שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם
19 במרץ 2018
פרוטוקול זה מתאר שיטת משופרת עבור אוסף עשיר של נוזל מוחי שדרתי (CSF) עם שום זיהום מדם. עם אוסף מדגם גדול יותר, טוהר, ניתוחים נוספים ניתן לבצע באמצעות נוזל מוחי-שדרתי כדי לקדם את ההבנה שלנו של מחלות המשפיעות על המוח ואת חוט השדרה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את איסוף נוזל המוח מעכברים ללא זיהום מדם. שיטה זו מספקת דרך קלה ואמינה לאסוף CSF לניטור הסמנים הביולוגיים של מחלות עצביות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתוספת עם המיקרומניפולטור כדי לסייע באיסוף CSF מעכברים מפחיתה את זיהום הדם במהלך האיסוף.
התחל בהנחת נימי זכוכית משוכים לתוך מחזיק נימי, המותקן היטב על מיקרומניפולטור. לאחר מכן, תוך כדי צפייה דרך מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים ישרים כדי לשבור את קצה הנימים המושחזים כך שהקוטר הפנימי של הקצה השבור יהיה כ-10 עד 20 מיקרון. לאחר מכן חבר צינור דק ומזרק לקצה השני של מחזיק הנימים, חבר את הצינור הדק ואת המזרק עם שסתום תלת כיווני והעבר את השסתום התלת-כיווני לפתיחה.
לאחר מכן צללו את המזרק כדי להוציא מזהמים וליצור לחץ חיובי בצינור הנימים. חזור על כך מספר פעמים על ידי ניתוק וחיבור מחדש של המזרק לשסתום התלת-כיווני. לאחר מכן שאב אוויר ל -100 עד 200 מיקרוליטר לפני החיבור הסופי של המזרק עם השסתום התלת-כיווני.
הזז את המיקרומניפולטור עם נימי הזכוכית הצידה כדי למנוע נזק במהלך ההליך הכירורגי. לפני תחילת הניתוח, ודא שהעכבר הורדם לחלוטין על ידי צביטה של כל ארבע הגפיים והתבוננות בהיעדר תגובה. לאחר מכן השתמש במספריים מנתחים כדי לחתוך ולקצץ את השיער בחלק האחורי של ראש העכבר מעל העיניים בין האוזניים לתחתית הצוואר.
אבטח את ראש העכבר באמצעות מתאם עכבר מסגרת סטריאוטקסית. ודא שהראש אינו יכול לזוז ומאובטח היטב במתאם על ידי דחיפה עדינה כלפי מטה על ראש העכבר. השתמש במספריים ובמלקחיים מעוקלים כדי לחתוך את עור העכבר על פני החלק האחורי של הצוואר ולאחר מכן במורד אמצע הגולגולת בין האוזניים והעיניים של העכבר.
משוך את העור והרקמות זה מזה והחוצה מהאזור שמעל בור המים המגנה. תוך כדי צפייה דרך מיקרוסקופ הניתוח, נתחו בזהירות את שכבות השריר הדקות האחרונות מעל בסיס הגולגולת באמצעות מלקחיים והזיזו את שכבות השריר הללו הצידה ומחוץ לאזור העניין. לאחר חשיפת הדורה מעל בור המים המגנה, השתמשו בצמר גפן רטוב כדי לנגב את הממברנה ולאחר מכן השתמשו בצמר גפן יבש כדי לייבש את האזור.
בור המים נראה משולש עם כלי דם אחד עד שניים גדולים העוברים באזור. שני הצדדים של כלי הדם או ביניהם אופטימליים להחדרת נימים ואיסוף CSF. לאחר חשיפת בור המים, השתמש במיקרומניפולטור כדי ליישר את נימי הזכוכית לחלק האחורי של ראש העכבר כך שהנקודה המושחזת תהיה ממש מאחורי הממברנה בזווית של 30 עד 45 מעלות.
לאחר מכן, צללו את המזרק פעם או כמה פעמים ואז הזיזו את הבוכנה לאחור 100 עד 200 מיקרוליטר כדי לוודא שאין מזהמים ויש לחץ שלילי בנימי הזכוכית. לאחר מכן קרב את קצה הנימים לקרום עד שניתן לראות התנגדות, אך מבלי לנקב את הממברנה. הקש על פקדי המיקרומניפולטור כדי להקיש בעדינות על צינור הנימים דרך הממברנה.
יש למשוך CSF אוטומטית לתוך צינור הנימים לאחר ניקוב הפתח. השאר את הנימים במקומו כדי לאסוף לאט CSF. אם ה-CSF הפסיק לזרום, משוך לאט את המזרק כלפי מעלה כ-50 מיקרוליטר כדי ליצור לחץ שלילי יותר בנימים.
עשרה עד 15 מיקרוליטר של CSF נאספים תוך 10 עד 30 דקות. לאחר איסוף הנפח הרצוי של CSF, סגור את הצינור על ידי הזזת השסתום התלת-כיווני כדי לסגור ולהסיר את המזרק המחובר לצינור. פתח ולאחר מכן סגור את הצינור כדי ליצור לחץ שווה בנימים, בצינור ובאזור שמחוץ לנימים.
לאחר מכן חבר מחדש את המזרק לפני שתסיר בעדינות את נימי הזכוכית מהעכבר באמצעות מיקרומניפולטור. לאחר מכן, הנח את צינור האיסוף המכיל מיקרוליטר אחד של מעכב פרוטאז פי 20 מתחת לנקודה המושחזת של נימי הזכוכית. פתח את הצינור וצלול בעדינות את המזרק.
ה-CSF צריך לזרום החוצה מהנימים לתוך צינור האיסוף. לאחר האיסוף, צנטריפוגה דופק את ה-CSF כדי לערבב את הדגימה עם מעכב הפרוטאז בתחתית צינור האיסוף. ניתן לאסוף דגימות CSF ולאחר מכן לאחסן אותן לניתוח נוסף במינוס 80 מעלות צלזיוס.
CSF שנאסף מעכברי APP/PS1 הראה עלייה משמעותית ברמות של בטא 42 אנושי בגיל 12 חודשים. בעכברים מסוג בר, לא זוהה בטא 42 אנושי. לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך שעה אחת אם הוא מבוצע כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מכלי דם בעת החדרת הנימים ולבצע התאמות קלות בלבד עם המיקרומניפולטור במהלך איסוף CSF כדי למנוע זיהום בדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת לאיסוף נוזל ח㔯שדרכי (CSF) מעכברים עם זיהום מינימלי של דם. באמצעות שימוש במיקרו-מניפולטור, טכניקה זו משפרת את טוהר הדגימה ואת נפחה, ובכך מאפשרת ניתוח טוב יותר של סמנים ביולוגיים במחלות נוירולוגיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח נוזל חבירה מוחי
- מחקר מחלות נוירולוגיות
רקע
- נוזל ה-CSF הוא קריטי להבנת מחלות המשפיעות על המוח וחוט השדרה.
- זיהום באמצעות דם במהלך האיסוף עלול לפגוע בממצאי המחקר.
- שיטות איסוף משופרות יכולות להגביר את שלמות הדגימה לצורך אנליזת סמנים ביולוגיים.
- טכניקה זו שואפת להקל על חקר מצבים של ניוון עצבי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה לאיסוף נוזל חוט השדרה (CSF) מעכברים.
- מזעור זיהום של הדם במהלך תהליך האיסוף.
- מתן אפשרות לניטור מדויק יותר של סמנים ביולוגיים למחלות נוירולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השיטה עושה שימוש במיקרו-מניפולטור עם קפילרה מזכוכית לצורך איסוף מדויק של CSF מה-cisterna magna.
- העכברים עוברים הרדמה נאותה, ונעשה שימוש בטכניקות כירורגיות כדי לחשוף את ה-cisterna magna לצורך החדרת הקפילרה.
- אין התייחסות לזרימות עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics); המיקוד הוא באיסוף CSF.
- ניתן להשלים את הפרוצדורה בערך בשעה אחת עם תרגול.
- לאחר האיסוף, ה-CSF מעורבב עם מעכב פרוטאז לצורך שימור.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת איסוף של 10 עד 15 microliters של CSF תוך 10 עד 30 דקות.
- CSF שנאסף מעכברי APP/PS1 הראה עלייה משמעותית ברמות של human A beta 42 בגיל 12 חודשים.
- לא זוהה A beta 42 בדגימות של עכברי wild-type.
- יעילות הפרוצדורה והיכולת למנוע זיהום בדם הוכחנו בהצלחה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה יעילה להשגת נוזל חוט השדרה (CSF) מעכברים תוך מזעור של זיהומים.
- הטוהר והנפח המשופרים של ה-CSF שנאסף יכולים לשפר את ניתוח הסמנים הביולוגיים במחקר של מחלות עצביות.
- הוא תורם להבנה טובה יותר של הדינמיקה של נוזל חוט השדרה בהפרעות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
איסוף מהימן של נוזל חוט השדרה (CSF) חיוני לגילוי סמנים ביולוגיים במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות, שבהם טוהר הדגימה משפיע ישירות על איכות הנתונים ועל רמת הוודאות באישור המטרה. שיטה זו נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי בזרימות העבודה של מדעי העצב בעכברים, בכך שהיא מאפשרת מיצוי CSF בתנובה גבוהה ובזיהום נמוך, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכנית חזקה יותר של היפותזות טיפוליות. נגישות משופרת ל-CSF מחזקת את הרציפות התרגומית מזיהוי המטרה ועד לניטור סמנים ביולוגיים בשלב הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ניתוח סממנים ביולוגיים במערכת הרלוונטית למחלה עם עמימות מכניסטית מופחתת.
- ערך תפעולי: מספק גישה הדירה ל-CSF למעקב ארוך טווח של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על סממנים ביולוגיים על ידי שיפור הביטחון בשינויים מולקולריים הקשורים למטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק דגימות CSF מופקת המתאימות לבדיקות כמותיות של סממנים ביולוגיים, ובכך משפר את מהימנות הסריקה.
- ערך תפעולי: מנרמל את הכנת הדגימות ומפחית את השונות בתהליכי העבודה האנליטיים העוקבים.
- יכולת הרחבה: מאפשר איסוף עקבי של CSF בין קבוצות שונות, ובכך תומך בתיקוף הבדיקה ובשחזור התוצאות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומכת בהתאמה של סממנים ביולוגיים משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות מודלים רלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת ניטור של סממנים ביולוגיים למטרה, כגון human A beta 42 בעכברי APP/PS1, ובכך מחזקת את הביטחון החזוי.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת קבלת החלטות על התקדמות המבוססת על נתונים, בהתבסס על שינויים ניתנים לזיהוי בסממנים ביולוגיים במודלים של מחלות עצביות.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי אספקת מקור דגימות אמין בשלבי המעלה (upstream) עבור אנליזה של סמנים ביולוגיים, ובכך מגשרת בין שלבי תיקוף המטרה (target validation) ואופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות מדידת סמנים ביולוגיים ב-CSF.
- סריקה: מאפשרת יצירת דגימות מוכנות לבדיקה עם נפח וטוהר עקביים לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של סמנים ביולוגיים (למשל, human A beta 42) המקילות על ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקה של סמנים ביולוגיים ב-CSF לבין התקדמות מחלה פרה-קלינית במודלים גנטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לאיסוף CSF בתוכניות גילוי בתחום מדעי העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות באמצעות נתוני ביומרקרים נקיים יותר ובנפח גבוה יותר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של איסוף CSF בין מעבדות ומחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת מספר הניסויים שנכשלו עקב דגימות מזוהמות או לא מספיקות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על תנודות מהימנות של ביומרקרים במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה ובתפעול מיקרו-מניפולטור לצורך מיקום מדויק של הנימיים.
- תלוי במיקרוסקופיה לניתוח, במסגרת סטריאוטקסית ובמכשור לטיפול בנוזלים.
- מחייב סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרוטוקולי הניתוח והאיסוף כדי להבטיח הדירות.
- התאמה למודלים אחרים עשויה לדרוש התאמות אנטומיות עקב שינויים בנגישות ל-cisterna magna.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות במיומנות המפעיל ושונות פיזיולוגית פוטנציאלית בתנובת ה-CSF.
