התגבשות חלבונים, קבלת סריג מוצק של ביומולקולים, מבהירה את מבנה החלבון ומאפשרת לחקור את תפקוד החלבון. התגבשות כרוכה בייבוש חלבון מטוהר תחת שילוב של גורמים רבים, כולל pH, טמפרטורה, חוזק יוני וריכוז חלבונים. לאחר קבלת הגבישים, מבנה החלבון יכול להיות מואר על ידי עקיפה של קרני רנטגן וחישוב של מודל צפיפות אלקטרונים.
וידאו זה מציג התגבשות חלבון ומציג הליך כללי. ביטוי חלבון וטיהור, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן מכוסים בהליך. יישומים של התגבשות חלבון כוללים בעיצוב תרופה סיליקו, קביעת אתר מחייב, וניתוח מבנה חלבון ממברנה.
התגבשות חלבונים, קבלת סריג מוצק של ביומולקולים, מבהירה את מבנה החלבון ומאפשרת לחקור את תפקוד החלבון. התגבשות כרוכה בייבוש חלבון מטוהר תחת שילוב של גורמים רבים, כולל pH, טמפרטורה, חוזק יוני וריכוז חלבונים. לאחר קבלת הגבישים, מבנה החלבון יכול להיות מואר על ידי עקיפה של קרני רנטגן וחישוב של מודל צפיפות אלקטרונים.
וידאו זה מציג התגבשות חלבון ומציג הליך כללי. ביטוי חלבון וטיהור, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן מכוסים בהליך. יישומים של התגבשות חלבון כוללים בעיצוב תרופה סיליקו, קביעת אתר מחייב, וניתוח מבנה חלבון ממברנה.
התגבשות חלבונים היא תהליך של השגת צורה מוצקה סותרת של חלבון. גבישים אלה הם בעלי ערך מיוחד לביולוגים מבניים, ומסייעים בחקר תפקוד החלבון. טכניקות אחרות, כגון מפרט מסה או SDS-PAGE, יכולות לספק מידע רק על המבנה החד-ממדי של חלבונים. התגבשות חלבונים משלימה את הטכניקות של ביטוי חלבון רקומביננטי עקיפה של קרני רנטגן. וידאו זה יציג את עקרונות התגבשות החלבון, הליך מעבדה כללי, וכמה מיישומיו בתחום הביוכימי.
הצעד הראשון הנדרש בתהליך הוא להשיג כמויות מיליגרם של חלבון טהור מאוד, בדרך כלל באמצעות ביטוי חלבון רקומביננטי. הגן המתאים לחלבון העניין משוכפל לווקטור ביטוי, והחלבון המבוטא מותך לתג זיקה, כגון פולי-היסטידין, כדי לסייע בטיהור על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. למידע נוסף, עיין בסרטון של אוסף זה על כרומטוגרפיה של זיקה.
היווצרות החלבון המטוהר לגבישים תלויה בשילוב הנכון של גורמים רבים, כולל pH, חוזק יוני, ריכוזים של משקעים וחלבון, טמפרטורה וקצב של שאיון. השיטה הנפוצה ביותר בשימוש היא דיפוזיה אדים, אשר ישנן שתי קטגוריות: תלייה טיפה וירידה בישיבה. טיפה המכילה חלבון טהור, חיץ ומים, שהיא מוצק יוני הקושר מולקולות מים, מפחיתה את זמינות המים לחלבון ומחקה ריכוז חלבון גבוה יותר, נמצאת במיקרווול סגור עם מאגר עם תערובת מרוכזת יותר של אותו חיץ ומשקעים. בהתחלה, ריכוזי החלבון והמים נמוכים מכדי לגרום להתגבשות. במהלך הניסוי, מים מתאדים מהטיפה ונאספים במאגר; ירידה בכמות המים בטיפת גורמת למערכת להיות רוויה, וההתגבשות, ואחריה התגבשות, יכולה להתרחש. ההעברה נטו של מים מהטיפה נמצאת בשיווי משקל, והמערכת נשמרת עד להשלמת התהליך.
כדי להציג באופן חזותי את המבנה התלת-ממדי, נעשה שימוש בעקיפת קרני רנטגן. כדי לקבל נתוני רנטגן מקריסטל, הוא ממוקם בקרן רנטגן מונוכרומטית, שם הוא חשוף לקרן בכל הזוויות. כל חשיפה מספקת תמונה, שבה כל נקודה היא צילום רנטגן מפוזר, שיוצא מהגביש ונרשם על ידי גלאי. הנתונים משולבים כדי לייצר מודל של סידור האטומים בתוך הגביש. מבנה הגביש המתקבל מדגים את המיקום התלת מימדי של האטומים, ברזולוציה אופיינית של 2 אנגסטרום.
כעת, לאחר שכיסינו את עקרונות התגבשות החלבון, הבה נבחן פרוטוקול כללי.
כדי להתחיל את ההליך וקטור ביטוי המכיל את גן העניין הופך לתאים. התאים דוגרים ובאמצע יומן הרישום, הביטוי מופעל על ידי הוספת תמריץ, כגון IPTG, מה שמפעיל את שעתוק ה- mRNA של הגן. לאחר ביטוי חלבון, החומר הגולמי מושעה במאגר תמוגה, ולאחר מכן הובהר על ידי צנטריפוגה.
לאחר מכן, הליסאט המובהר נטען על עמוד ניקל, והחלבון המתויג בפוליהיסטידין נקשר לעמודה בזמן שכל הביומולקולים האחרים נשטפים.
לאחר כמה מיליגרם של חלבון טהור הושגו, הוא מוכן להתגבש על ידי דיפוזיה אדים. מגש טיפה תלוי/יושב 24 היטב מלא בריכוזים שונים של פתרונות חיץ נתרן כלורי ונתרן אצטט. עבור שיטת טיפת הישיבה, כמויות שוות של חלבון ופתרון מאגר מועברים על המדף מעל כל באר, ולאחר מכן המגש מכוסה בסרט שקוף. המגש ממוקם לאחר מכן בתא דגירה, והברות מנוטרות לצמיחה למחרת, ואז כל כמה ימים.
לאחר גבישי מתאים הושג הוא מוכן לניתוח עקיפה רנטגן. הגביש מותקן על גוניומטר כדי למקם את הגביש באוריינטציות נבחרות. הגביש מואר בקרן מונוכרומטית של צילומי רנטגן בכל הזוויות, ומייצר תבנית עקיפה. התוכנה ממירה את התמונות הדו-ממדיות, שצולמו באוריינטציות שונות, למודל תלת מימדי של צפיפות האלקטרונים בתוך הגביש על ידי קביעת מיקומי האטומים בגביש.
עכשיו שבדקנו הליך, בואו נסקור כמה יישומים שימושיים של התגבשות חלבונים, וטכניקת התגבשות נוספת.
התגבשות חלבון עשויה לשמש בעיצוב תרופות סיליקו. המבנה התלת מימדי של חלבון בסיסי פולימראז של נגיף השפעת 2, אשר נקשר לזיהום ויראלי ביונקים, נקבע על ידי התגבשות עקיפה של קרני רנטגן. אתרי כריכה פוטנציאליים בחלבון דמיינו, ועם השימוש בתוכנית עגינה, תוכננה מולקולה תלת ממדית שתכניס לשסע בחלבון.
התגבשות משותפת של קומפלקסים של חלבון-DNA היא גם טכניקה שימושית. חלבונים מחייבי דנ"א מווסתים מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות כגון שעתוק ופימור DNA ותיקון DNA; ומבני קריסטל של מתחמים אלה יכולים לספק תובנה על תפקוד החלבון, המנגנון ואופי האינטראקציה הספציפית. החלבון E. coli SeqA, רגולטור שלילי של שכפול DNA, התגבש במשותף עם DNA המימתילציה.
חלבונים ממברנה אינטגרליים כגון קולטנים מצמידים לחלבון G, או GCPRs, קשה לגבש בשל הכמות המוגבלת שלהם של שטח הפנים הקוטבי הזמין ליצירת מגעים סריג קריסטל, אשר הוביל לפיתוח של היתוך-חלבון בסיוע חלבון התגבשות חלבון. גנים קידוד β2 קולטן adrenergic, GCPR, וליזוזים הוכנסו לתוך וקטור ביטוי. התגבשותו של חלבון ההיתוך β2AR-lysozyme הושגה בשל המשטח ההידרופילי החוץ-תאי המוגבר מעל β2AR ההידרופובי הטבעי, המסופק על ידי ליזוזים, הדרוש ליצירת אינטראקציות אריזה בסריג הקריסטל.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על התגבשות חלבונים. סרטון זה תיאר את עקרונותיו, פרוטוקול כללי, וחלק מהשימושים בו בתחום הביו-רפואי. תודה שצפיתם!
התגבשות חלבונים, קבלת סריג מוצק של ביומולקולים, מבהירה את מבנה החלבון ומאפשרת לחקור את תפקוד החלבון. התגבשות כרוכה בייבוש חלבון מטוהר תחת שילוב של גורמים רבים, כולל pH, טמפרטורה, חוזק יוני וריכוז חלבונים. לאחר קבלת הגבישים, מבנה החלבון יכול להיות מואר על ידי עקיפה של קרני רנטגן וחישוב של מודל צפיפות אלקטרונים.
וידאו זה מציג התגבשות חלבון ומציג הליך כללי. ביטוי חלבון וטיהור, התגבשות, עקיפה של קרני רנטגן מכוסים בהליך. יישומים של התגבשות חלבון כוללים בעיצוב תרופה סיליקו, קביעת אתר מחייב, וניתוח מבנה חלבון ממברנה.
התגבשות חלבון היא תהליך של השגת צורה מוצקה סריגית של חלבון. גבישים אלה חשובים במיוחד לביולוגים מבניים, ומסייעים בחקר תפקוד החלבון. טכניקות אחרות, כגון מפרט מסה או SDS-PAGE, יכולות לספק מידע רק על המבנה החד-ממדי של חלבונים. התגבשות חלבון משלימה על ידי טכניקות של ביטוי חלבון רקומביננטי ועקיפה של קרני רנטגן. סרטון זה יציג את עקרונות התגבשות החלבונים, הליך מעבדתי כללי וכמה מהיישומים שלו בתחום הביוכימי.
השלב הראשון הנדרש בתהליך הוא השגת כמויות של מיליגרם של חלבון טהור מאוד, בדרך כלל באמצעות ביטוי חלבון רקומביננטי. הגן המתאים לחלבון המעניין משובט לווקטור ביטוי, והחלבון המבוטא מתמזג לתג זיקה, כגון פולי-היסטידין, כדי לסייע בטיהור על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. למידע נוסף, ראה את הסרטון של אוסף זה על כרומטוגרפיה של זיקה.
היווצרות החלבון המטוהר לגבישים תלויה בשילוב נכון של גורמים רבים, כולל pH, חוזק יוני, ריכוזי משקעים וחלבון, טמפרטורה וקצב שיווי משקל. השיטה הנפוצה ביותר בשימוש היא דיפוזיה של אדים, ממנה ישנן שתי קטגוריות: טיפה תלויה וטיפת ישיבה. טיפה המכילה חלבון טהור, בופר ומשקעים, שהיא מוצק יוני הקושר מולקולות מים, מפחית את זמינות המים לחלבון ומחקה ריכוז חלבון גבוה יותר, נמצאת במיקרו-באר סגורה עם מאגר עם תערובת מרוכזת יותר של אותו מאגר ומשקעים. בהתחלה, ריכוזי החלבון והמשקעים נמוכים מכדי לגרום להתגבשות. במהלך הניסוי מים מתאדים מהטיפה ונאספים במאגר; ירידה בכמות המים בטיפה גורמת למערכת להיות רוויה במיוחד, והתגרענות, ואחריה התגבשות, יכולה להתרחש. העברת המים נטו מהטיפה נמצאת בשיווי משקל, והמערכת נשמרת עד להשלמת התהליך.
כדי להמחיש את המבנה התלת-ממדי, נעשה שימוש בעקיפה של קרני רנטגן. כדי להשיג נתוני רנטגן מגביש, הוא ממוקם בקרן רנטגן מונוכרומטית, שם הוא חשוף לקרן בכל הזוויות. כל חשיפה מספקת תמונה, כאשר כל נקודה היא צילום רנטגן עקיף, היוצא מהגביש ונרשם על ידי גלאי. הנתונים משולבים כדי לייצר מודל של סידור האטומים בתוך הגביש. מבנה הגביש המתקבל מדגים את המיקום התלת-ממדי של האטומים, ברזולוציה אופיינית של 2 אנגסטרומים.
כעת, לאחר שכיסינו את עקרונות התגבשות החלבון, הבה נסתכל על פרוטוקול כללי.
כדי להתחיל בהליך, וקטור ביטוי המכיל את הגן המעניין הופך לתאים. התאים מודגרים ובשלב אמצע הלוג, הביטוי מתחיל על ידי הוספת משרה כגון IPTG, המעורר שעתוק של ה-mRNA של הגן. לאחר ביטוי החלבון, החומר הגולמי מושעה במאגר ליזה, ולאחר מכן מובהר על ידי צנטריפוגה.
הליזט המובהר נטען לאחר מכן על עמוד ניקל, והחלבון המתויג בפוליהיסטידין נקשר לעמודה בזמן שכל שאר הביו-מולקולות נשטפות.
לאחר שהתקבלו מספר מיליגרם של חלבון טהור, הוא מוכן להתגבשות על ידי דיפוזיה של אדים. מגש טיפה תלוי/ישיבה עם 24 בארות מלא בריכוזים משתנים של תמיסות חיץ נתרן כלורי ונתרן אצטט. לשיטת טיפת הישיבה, כמויות שוות של תמיסת חלבון ומאגר מונחות על המדף שמעל כל באר, ואז המגש מכוסה בסרט שקוף. לאחר מכן מניחים את המגש בתא דגירה, והבארות מנוטרות לצמיחה למחרת, ואז כל כמה ימים.
לאחר שהתקבל גביש תקין הוא מוכן לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. הגביש מותקן על גוניומטר כדי למקם את הגביש בכיוונים נבחרים. הגביש מואר בקרן מונוכרומטית של קרני רנטגן בכל הזוויות, ויוצר דפוס עקיפה. התוכנה ממירה את התמונות הדו-ממדיות, שצולמו בכיוונים שונים, למודל תלת מימדי של צפיפות האלקטרונים בתוך הגביש על ידי קביעת מיקומי האטומים בגביש.
כעת, לאחר שסקרנו הליך, בואו נסקור כמה יישומים שימושיים של התגבשות חלבונים, וטכניקת התגבשות נוספת.
ניתן להשתמש בהתגבשות חלבון בתכנון תרופות סיליקו. המבנה התלת-ממדי של החלבון הבסיסי פולימראז 2 של נגיף השפעת, שנקשר לזיהום ויראלי ביונקים, נקבע על ידי התגבשות ועקיפה של קרני רנטגן. אתרי קשירה פוטנציאליים בחלבון מומחשים, ובעזרת תוכנית עגינה, תוכננה מולקולה תלת מימדית שתיכנס לתוך סדק בחלבון.
התגבשות משותפת של קומפלקסים של חלבון-DNA היא גם טכניקה שימושית. חלבונים קושרי DNA מווסתים מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות כגון שעתוק ופימור DNA ותיקון DNA; ומבני גביש של קומפלקסים אלה יכולים לספק תובנה לגבי תפקוד החלבון, המנגנון ואופי האינטראקציה הספציפית. חלבון E. coli SeqA, מווסת שלילי של שכפול DNA, התגבש יחד עם DNA המימתיליזציה.
חלבוני ממברנה אינטגרליים כגון קולטנים מצומדים לחלבון G, או GCPRs, קשים להתגבש בשל הכמות המוגבלת של שטח הפנים הקוטבי הזמין ליצירת מגעי סריג גבישים, מה שהוביל להתפתחות התגבשות חלבון בעזרת חלבון היתוך. גנים המקודדים קולטן אדרנרגי ?2, GCPR וליזוזים הוכנסו לווקטור ביטוי. התגבשות חלבון ההיתוך ?2AR- ליזוזים הושגה עקב המשטח ההידרופילי החוץ-תאי המוגבר על פני ההידרופוביה הטבעית ?2AR, המסופק על ידי הליזוזים, הדרוש ליצירת אינטראקציות אריזה בסריג הגביש.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על התגבשות חלבונים. סרטון זה תיאר את עקרונותיו, פרוטוקול כללי וכמה שימושים שלו בתחום הביו-רפואי. תודה שצפית!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
Videos from this collection: