תוחם ניידות אלקטרופורטית (EMSA)

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

JoVE Science Education
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Biochemistry

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Previous Video

4.2: Enzyme Assays and Kinetics

Next Video

4.11: Density Gradient Ultracentrifugation

44,550 Views

•

06:57 min

•

April 30, 2023

Overview

בדיקת משמרות ניידות אלקטרופורטית (EMSA) הוא הליך ביוכימי המשמש לביאור כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. בבדיקה זו תערובת של חומצת גרעין עם תווית רדיו וחלבון בדיקה. הכריכה נקבעת באמצעות אלקטרופורזה ג’ל המפרידה בין רכיבים המבוססים על מסה, מטען וקונפורמציה.

וידאו זה מציג את המושגים של EMSA והליך כללי, כולל הכנת ג’ל וחלבון, כריכה, אלקטרופורזה וזיהוי. יישומים המכוסים בסרטון זה כוללים ניתוח של אנזימים לשיפוץ כרומטין, EMSA שונה המשלב ביונטינילציה, ומחקר של אתרים מחייבים של רגולטורים תגובה חיידקית.

EMSA, תפילת הניידות האלקטרופורטית, הידועה גם בשם בדיקות הזזת ג’ל, היא הליך ביוכימי רב-תכליתי ורגיש. EMSA מדרכת כריכה בין חלבונים וחומצות גרעין על ידי זיהוי שינוי ברצועות באלקטרופורזה של ג’ל.

סרטון וידאו זה מתאר את העקרונות של EMSA, מספק הליך כללי, ודן ביישומים מסוימים.

שכפול DNA, שעתוק ותיקון, כמו גם עיבוד RNA הם כולם תהליכים ביוכימיים קריטיים. כולם כרוכים בכריכה בין חלבונים וחומצות גרעין. מחלות והפרעות חמורות רבות קשורות לשינויים בכריכה זו. EMSA היא טכניקה לקביעת איכות אם חלבון מסוים נקשר לחומצת גרעין ספציפית. ראשית, חומצת הגרעין מסומנת, בדרך כלל עם זרחן רדיואקטיבי-32, כדי ליצור בדיקה. ואז חלבון הבדיקה וחפצת גרעין מעורבבים. כאשר חלבון נקשר לבדיקת חומצת גרעין, לתסביך המתקבל יש מסה גדולה יותר וקונפורמציה שונה מחומצת הגרעין בלבד.

לאחר כבול, המתחמים מנותחים עם אלקטרופורזה ג’ל. בטכניקה זו, שדה חשמלי מאלץ מקרומולקולים לעבור דרך מטריצת ג’ל. הרכיבים נפרדים בהתבסס על מסה, טעינה וקונפורמציה. אלקטרופורזה יכולה להפריד בין קומפלקסים של חלבון-דנ”א לבדיקות לא מאוגדות. מכיוון שיש להם מסות וקונפורמציות שונות, הם יעברו דרך הג’ל בקצבים שונים וינפרדו. ההפרדה מזוהה בקלות, הודות לנוכחות של הזרחן הרדיואקטיבי, ומוכיחה שהחלבון נקשר בהצלחה לחומצת הגרעין הנתונה. כדי לאמת את זיהוי החלבון, “בדיקה על-גופית” משתמשת בנוגדן בעל זיקה ידועה לחלבון. יש לכך יתרון נוסף של הסטה נוספת של הרזולוציה המורכבת וההולכת וגדלה.

עכשיו שראינו את העקרונות, בואו נראה את זה במעבדה.

כדי להתחיל את ההליך, החלבון חייב להיות מבודד. כדי לעשות זאת, טכניקות ביולוגיה מולקולרית משמשות כדי לבטא את החלבון בתאים, ולאחר מכן לטהר.

חומצת הגרעין מוגברת ומסומנת כדי ליצור בדיקה. תיוג נעשה באמצעות דגירה במשך 10 דקות עם dCTP המכיל זרחן רדיואקטיבי-32. יש צורך בכס עבודה בטוח לקרינה וציוד מגן.

לאחר מכן מכינים את הג’ל. הג’ל צריך להיות לא denaturing, כדי למנוע את החלבון משינוי קונפורמציה ואולי להתיר מן הבדיקה במהלך אלקטרופורזה. ג’ל Polyacrylamide יש גדלי נקבוביות של 5 עד 20 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות קצרות עד 100 זוגות בסיס אורך. ג’לים אגרוז יש גדלי נקבוביות של 70-700 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות גדולות יותר.

עם החלבון וחומצת הגרעין מוכנה כעת, אנו ממשיכים בכריכה. פתרון חיץ TRIS מוכן ואת החלבון ואת הבדיקה מתווספים. ה- pH צריך להיות דומה לתנאים פיזיולוגיים, וריכוז מלח מספיק כדי למנוע מהחלבון ליצור קשרים חלשים עם חומצות גרעין שאינן ממוקדות. התגובה ממשיכה במשך 20-30 דקות ב 4 °C (50 °F).

השלב הבא הוא אלקטרופורזה. מאגר של חוזק יוני נמוך ו- pH דומה לזה המשמש בתגובת האיגוד מנוצל. היא מניבה “אפקט הזדקנות” המייצב מתחמים, מגביר את הניידות ומפחית את ייצור החום. לאחר אלקטרופורזה, רכיבי הג’ל מועברים על נייר מסנן. בחדר חשוך, נייר הסינון נחשף לאחר מכן לסרט. אם החלבון נקשר לגשוש, שני אזורים מסומנים נפרדים יהיו גלויים בהעברה. אחד המייצג את המתחם, ואחד נפרד המייצג את הבדיקה הלא מאוגדת. ההפרדה מדגימה כי החלבון קשור בהצלחה לחומצת הגרעין.

עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.

כרומטין הוא קומפלקס צפוף של DNA וחלבונים שנמצאו תאים אאוקריוטים. אנזימי שיפוץ כרומטין משנים את המבנה כדי לפתוח את הדנ”א לתעתיק. כמו זה משנה את הניידות של המתחם, EMSA יכול לשמש כדי לחקור את הפעילות המחייבת של האנזים.

גישה חלופית לתיוג מנצלת את האינטראקציה בין DNA לבין האנזים מתיל-רנספראז. קופקטור יכול להיות שונה כדי להיקשר לצמיתות לדנ”א באמצעות מתילטרנספראז. במקום תיוג עם זרחן-32, קופקטור הוא מצומד ביוטין, וזה יתרון כי זה לא רדיואקטיבי. מכיוון שהשופץ הוא ספציפי לאתר בקובץ המצורף שלו, הוא רלוונטי לגנוטיפינג, זיהוי מתילציה ואספקת גנים. חומצות הגרעין הביוטיליטיות מזוהות באמצעות פלואורסצנטיות אולטרה סגולה.

כאשר גירויים סביבתיים להפעיל קינאז היסטידין, “רגולטור תגובה” הוא זרחן. זה בתורו נקשר לדנ”א, המשפיע על שעתוק, אשר ניתן ללמוד על ידי EMSA. לדוגמה, רגולטור תגובה Desulfovibrio וולגריס הוכח להיקשר לגן של עניין. EMSA שימש כדי לוודא שהאיגוד התקיים.

הרגע צפית בסרטון של ג’וב על משמרת הניידות האלקטרופורטית. כעת עליך להבין את עקרונות הפעולה שלו, את השלבים בהליך שלה ואת הפרמטרים העיקריים של ההפעלה.

תודה שצפיתם!

Procedure

סרטון וידאו זה מתאר את העקרונות של EMSA, מספק הליך כללי, ודן ביישומים מסוימים.

עכשיו שראינו את העקרונות, בואו נראה את זה במעבדה.

עכשיו שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.

תודה שצפיתם!

Transcript

EMSA, בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית, הידועה גם בשם בדיקת שינוי הג’ל, היא הליך ביוכימי רב-תכליתי ורגיש. EMSA מבהיר את הקישור בין חלבונים לחומצות גרעין על ידי זיהוי שינוי ברצועות באלקטרופורזה של ג’ל.

סרטון זה מתאר את העקרונות של EMSA, מספק נוהל כללי ודן בכמה יישומים.

שכפול, שעתוק ותיקון DNA, כמו גם עיבוד RNA הם כולם תהליכים ביוכימיים קריטיים. כולם כרוכים בקישור בין חלבונים לחומצות גרעין. מחלות והפרעות קשות רבות קשורות לשינויים בכריכה זו. EMSA היא טכניקה לקביעה איכותית אם חלבון ספציפי נקשר לחומצת גרעין ספציפית. ראשית, חומצת הגרעין מסומנת, בדרך כלל עם זרחן רדיואקטיבי-32, כדי ליצור בדיקה. ואז מערבבים את חלבון הבדיקה ובדיקת חומצת הגרעין. כאשר חלבון נקשר לבדיקה של חומצת גרעין, לקומפלקס המתקבל יש מסה גדולה יותר וקונפורמציה שונה מחומצת הגרעין בלבד.

לאחר הקשירה, הקומפלקסים מנותחים באמצעות אלקטרופורזה של ג’ל. בטכניקה זו, שדה חשמלי מאלץ מקרומולקולות לנדוד דרך מטריצת ג’ל. הרכיבים נפרדים על סמך מסה, מטען וקונפורמציה. אלקטרופורזה יכולה להפריד קומפלקסים של חלבון-DNA מבדיקות לא קשורות. מכיוון שיש להם מסות וקונפורמציות שונות, הם ינדדו דרך הג’ל בקצבים שונים וייפרדו. ההפרדה מתגלה בקלות, הודות לנוכחות הזרחן הרדיואקטיבי, ומוכיחה שהחלבון נקשר בהצלחה לחומצת הגרעין הנתונה. כדי לאמת את זיהוי החלבון, “בדיקת סופר-שיפט” משתמשת בנוגדנים בעלי זיקה ידועה לחלבון. יש לכך יתרון נוסף של שינוי נוסף ברזולוציה המורכבת, הגדלת הרזולוציה.

עכשיו שראינו את העקרונות, בואו נראה את זה במעבדה.

כדי להתחיל בהליך, יש לבודד את החלבון. לשם כך משתמשים בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כדי לבטא את החלבון בתאים, ולאחר מכן לטהר.

חומצת הגרעין מוגברת ומסומנת ליצירת בדיקה. התיוג נעשה באמצעות דגירה למשך 10 דקות עם dCTP המכיל זרחן רדיואקטיבי-32. נדרשים שולחן עבודה בטוח לקרינה וציוד מגן.

לאחר מכן מכינים את הג’ל. הג’ל צריך להיות ללא דנטורציה, כדי למנוע מהחלבון לשנות את הקונפורמציה ועלול להתנתק מהגשושית במהלך האלקטרופורזה. לג’לים פוליאקרילאמיד יש גדלי נקבוביות של 5 עד 20 ננומטר והם שימושיים עבור בדיקות קצרות באורך של עד 100 זוגות בסיסים. לג’ל אגרוז יש גדלי נקבוביות של 70-700 ננומטר והם שימושיים לבדיקות גדולות יותר.

עם הכנת החלבון וחומצת הגרעין כעת, אנו ממשיכים לקשירה. מכינים תמיסת חיץ TRIS ומוסיפים את החלבון והבדיקה. ה-pH צריך להיות דומה לתנאים פיזיולוגיים, וריכוז המלח מספיק כדי למנוע מהחלבון ליצור קשרים חלשים עם חומצות גרעין שאינן מטרה. התגובה נמשכת 20-30 דקות ב-4 ?C.

השלב הבא הוא אלקטרופורזה. נעשה שימוש במאגר בעל חוזק יוני נמוך ו-pH דומה לזה המשמש בתגובת הקשירה. זה מניב “אפקט כלוב” המייצב מתחמים, מגביר את הניידות ומפחית את ייצור החום. לאחר אלקטרופורזה, מרכיבי הג’ל מועברים על נייר פילטר. בחדר חשוך, נייר הסינון נחשף לאחר מכן לסרט. אם החלבון נקשר לבדיקה, שני אזורים מסומנים נפרדים יהיו גלויים בהעברה. אחד מייצג את המכלול, ואחד נפרד מייצג את הגשושית הלא קשורה. ההפרדה מדגימה שהחלבון נקשר בהצלחה לחומצת הגרעין.

כעת, לאחר שראינו את ההליך הבסיסי, בואו נסתכל על כמה יישומים.

כרומטין הוא קומפלקס ארוז היטב של DNA וחלבונים המצויים בתאים אוקריוטיים. אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין משנים את המבנה כדי לפתוח את ה-DNA לשעתוק. מכיוון שהדבר משנה את הניידות של הקומפלקס, ניתן להשתמש ב-EMSA כדי לחקור את פעילות הקישור של האנזים.

גישה חלופית לתיוג מנצלת את האינטראקציה בין DNA לאנזים methyltransferase. ניתן לשנות קופקטור כך שייקשר לצמיתות ל-DNA באמצעות מתילטרנספראז. במקום לתייג עם זרחן-32, הקו-פקטור מצומד לביוטין, וזה יתרון מכיוון שהוא לא רדיואקטיבי.? מכיוון שהקו-פקטור הוא ספציפי לאתר בהתקשרותו, הוא רלוונטי לגנוטיפ, זיהוי מתילציה והעברת גנים. חומצות הגרעין הביוטיניות מתגלות באמצעות פלואורסצנציה אולטרה סגולה.

כאשר גירויים סביבתיים מפעילים היסטידין קינאזות, “מווסת תגובה? הוא זרחני. זה בתורו נקשר ל-DNA, ומשפיע על שעתוק, אותו ניתן לחקור על ידי EMSA.? למשל, רגולטור תגובה ב? Desulfovibrio vulgaris?הוכח כקשור לגן המעניין. נעשה שימוש ב-EMSA כדי לוודא שהכריכה אכן התרחשה.

זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית. כעת עליך להבין את עקרונות הפעולה שלו, את השלבים בהליך שלו ואת פרמטרי ההפעלה העיקריים שלו.

תודה שצפית!