עיבוד של טכנולוגיית מערך Microelectrode לחקר הרדמה-induced Neurotoxicity במוח חזרזיר שלם

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא להשתמש ביישום חדשני של טכנולוגיית מערך מיקרואלקטרודות מבוססת אנזימים למדידת נוירוטרנסמיטורים בחזירונים יילודים. בדוגמה זו, נבדקת פעילות גלוטמט in vivo כדי לחקור רעילות עצבית הנגרמת על ידי הרדמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה למדוד פעילות נוירוטרנסמיטר in vivo עם רזולוציה מרחבית וזמנית יוצאת דופן במודל בעלי חיים רלוונטי קלינית של נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי הרדמה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנונים של רעילות עצבית הנגרמת על ידי הרדמה, ניתן ליישם אותה גם במצבים פתולוגיים אחרים, כגון טראומה מוחית בילדים, אפילפסיה ושבץ מוחי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהשימוש במודל החזרזיר דורש ניסיון ותרגול ביישום. בנוסף, השימוש במערכי מיקרואלקטרודות דורש מערך מיומנויות מיוחד.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המיקום הכירורגיים והמיקרואלקטרודות בגלל אופיים העדין. עבור הניסוי הזה, השתמשו בחזירונים בזמן השיא של גדילת המוח שלהם, כשהם בני שלושה עד חמישה ימים. אפשרו להם להתאקלם לפחות 24 שעות לפני הניסוי.

צוות מיומן חייב לטפל בחזירונים. יש לספק להם גישה לתזונה, שמיכות וכמה צעצועים לגירויים. לפחות שלוש שעות לפני ההרדמה, הוציאו את תחליף החלב מהכלוב כדי לוודא שהבטן של החזרזיר ריקה.

עקוב אחר הנחיות ARRIVE כדי לחסל כל מבלבל פוטנציאלי מבוסס מין. מאוחר יותר, בתחנת עבודה להרדמה המצוידת במכונת הנשמה לילדים ומכשירי ניטור מתאימים, יש להחדיר ולאוורר מכנית את החזרזיר. לאחר מכן, יש לתת הרדמה סבופלורן ב-1 MAC למשך 3.5 שעות הרדמה.

כעת, השתמש בצביטה בבוהן כדי לאשר עומק הרדמה מתאים, ולאחר מכן הצמיד את החזרזיר למסגרת סטריאוטקסית ספציפית לחזרזיר שיש לה ריפוד מתאים. מקם את שיני הלסת העליונה מעל מוט השן. לאחר מכן, תקן והדק את שני מוטות האוזניים החודרים כשהחזרזיר מרוכז בקו האמצע.

הכנס את מוטות האוזניים חזק מספיק כדי לשמוע את קרומי התוף קופצים. התחל מנת העמסת רוקורוניום ועירוי כדי למנוע תנועות בזמן שהחזרזיר מאובטח במסגרת. חיוני שהחזרזיר יישאר חם, ומעקב אחר הסימנים החיוניים שלו.

השתמש במנורת חום, ו/או שמיכה, כדי לשמור על תרמיה תקינה. ודא שמנורת החום לא כל כך קרובה שהיא נשרפת. אם רוצים הישרדות חזרזירים, יש לנקוט בתכשירים נוספים כדי לשמור על שדה הניתוח סטרילי.

כעת, המשך בהשתלת מערך המיקרואלקטרודות. כדי להתחיל, צור חתך בקו האמצע של ארבעה עד שישה סנטימטרים לאורך הגולגולת, תוך שימוש בזהירות כדי להימנע מניקוד הגולגולת עם האזמל. לאחר ביצוע החתך, השתמש בנסיגה עדינה ובדיסקציה קהה כדי להרים את הקרקפת מהגולגולת.

לאחר מכן, שפשפו בעדינות את הגולגולת עם כרית גזה כדי להסיר כל רקמת חיבור ולחשוף את קווי התפרים. לאחר מכן קבע את המיקום המיועד לכריתת הגולגולת. אם אזור העניין נשאר מעורפל, שקף עוד יותר את הקרקפת.

כעת, השתמש במקדחה כירורגית כדי ליצור חלון גולגולת בגודל של כ-0.25 סנטימטרים רבועים המכסה את המבנה המבוקש. היזהר לא לפגוע בדורה או במוח שמתחתיו. לפי הצורך, השתמש בכלים כירורגיים עדינים כדי לכרות את הדורה המכסה את רקמת המוח.

השתמש בזהירות רבה כדי להימנע מפגיעה במוח. ניסוי זה משתמש במערך מיקרואלקטרודות מבוסס אנזים שתואר קודם לכן מצופה מראש בגלוטמט אוקסידאז, ומצופה ב-mPD. למערכי המיקרו-אלקטרודות יש פיר קשיח של 40 מילימטר, המותאם לשימוש עם חזירונים.

אבטח את זרוע המתכת למיקרו-מניפולטור, ולאחר מכן מקם את מערך המיקרו-אלקטרודות בצורה אנכית ככל האפשר מעל ברגמה. לאחר מכן, הורד בזהירות את המערך נמוך ככל האפשר מבלי לגעת במשטח הגולגולת, תוך שים לב לקואורדינטות של ברגמה. כעת השתמש באטלס מוח חזרזיר כדי לקבוע את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות המדויקות של המבנה המעניין, ולאחר מכן מקם מחדש את המיקרו-אלקטרודה בהתאם.

לאחר מכן, הנח את האלקטרודה הפסאודו-ייחוס מתחת לקרקפת, והבטיח מגע עם החיה. כעת הורידו לאט לאט את מערך המיקרואלקטרודות לתוך המוח כמעט לעומק המתאים. עבור שני המילימטרים האחרונים של הנסיעה, השתמש במיקרו-כונן הידראולי כדי להוריד בעדינות את המערך למבנה המעניין עם מינימום טראומה לרקמות.

לאחר מיקום מערך המיקרו-אלקטרודות, המתן 30 דקות כדי לאפשר לאלקטרודות להגיע לקו הבסיס. לאחר מכן, בצע מדידות במשך כשלוש שעות. אם החזרזיר אמור לשרוד את הניסוי, סגור את החתך לאחר איסוף הנתונים.

מדידות גלוטמט בזמן אמת נלקחו בהיפוקמפוס של חזרזירים בני שלושה עד ארבעה ימים בהרדמה סבופלורנית, כמתואר. מפגשי ההקלטה נמשכו יותר משלוש שעות. מדידות אמפרומטריה נרשמו ב-4 הרץ, והומרו לריכוז באמצעות רגרסיה ליניארית המבוססת על פרמטרי כיול.

עבור כל נקודת זמן, האותות משני האתרים הרגישים לגלוטמט היו ממוצעים לפני הפחתת אות הזקיף הממוצע, כדי להניב אות גלוטמט מתוקן. ריכוז הגלוטמט הבסיסי הממוצע היה כ-4.6 מיקרומול, ונשאר יציב יחסית במהלך החשיפה להרדמה. פעילות גלוטמטרגית חולפת זוהתה על ידי ניתוח שיאים באות שלא היו בקורלציה עם אות הזקיף, והיה להם יחס אות לרעש גדול משלושה.

בסך הכל זוהו 116 פסגות חולפות במהלך תקופת הניסוי. המשרעת של הפסגות החולפות שהתקבלו נצפתה בדרך כלל בטווח של 1 מיקרומול. על מנת לכמת את משך הזמן של כל חולף, הושג הזמן הדרוש לכל ערך שיא מקסימלי לדעיכה של 80%, ונמצא כ-4 עד 5.5 שניות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות, אם היא מבוצעת בשיטתיות ובזהירות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער כל נזק לא מכוון לרקמות שעלול לבלבל את נתוני הניסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מדידה של אנליטים אלקטרוכימיים אחרים, על מנת לענות על שאלות נוספות.