א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

אנו מתארים כאן לראשונה שיטה המאפשרת הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה עבור תרכובות senotherapeutic אשר הוכחו להיות מועיל במחלות הקשורות להזדקנות. למעשה, מספר ניסויים קליניים עם תרופות שנבדקו במהות זו נמשכים כעת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא להבחין בין שני סוגים של תרופות senotherapeutic, סנוליטיקה וסנומורפיה, באמצעות גילוי מבוסס היטב של SA-בטא-Galactosidase בתאים senescent.

טכניקה זו היא כלי הקרנה חשוב עבור תרכובות senotherapeutic הרומן. למעשה, מספר תרכובות שזוהו בעזרת מסך זה מוצגות בפרסומים שונים בעלי פרופיל גבוה, וכיום נמצאות בניסוי קליני. טכניקה זו היא רב-תכליתית ביותר, וייתכן שתותאם למספר מסכי תפוקה גבוהה.

למעשה, זה אפשרי מסכי מולטיפלקס, ומסך עבור תרכובות לדכא senescence באמצעות הפעלה או עיכוב של אחד מכמה מסלולים. טחון כל עובר לחתיכות מילימטר אחד צינור אותו למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של צמיחה בינוני לרקמות של כל עובר.

צלחת אותם בצלחת תרבות 10 ס"מ, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 3% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים. ו דגירה שאר העובר עם 0.25% טריפסין EDTA תערובת במשך 10 דקות. כדי לנסות את התאים, הראשון, להסיר בזהירות את מדיום הצמיחה ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של 1X PBS פעמיים.

לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של פתרון EDTA טריפסין 025 לתאים, ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מנותקים מפני השטח. הוסף את אותה כמות של מדיום צמיחה כדי לסיים את העיכול טריפסין, ולהעביר את התאים צינור חרוט.

לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף מדיום צמיחה טרי כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר מכן, ספור את התאים וזרע אותם בצלחות חדשות בצפיפות התאים המוקרנת.

עבור תת-תרבות לא חושית, ראשית, פצל תאים נוחים ביחס של 1 עד 4. ואז דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 3%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני כדי להרחיב למעבר אחר. לאחר מכן, כדי לגרום לחוש בתאים, זרע לפצל תאים confluent ממעבר אחד ביחס של אחד עד ארבעה דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ב 20%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך שלושה ימים.

כדי לנטר את הרגישות התאית, באמצעות מערכת מתקדמת של מונה תאי קולטר, למדוד את הגידול ההדרגתי בקוטר התא ובנפח התאים במהלך כל שלב של טריפסיוניזציה. כדי להתחיל בדיקות סינון בטא-גל, זרע 5, 000 תאים senescent או 3, 000 תאים שאינם senescent לגם ב 96 צלחות היטב. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של צמיחה בינוני לכל באר תאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 20% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות.

לאחר מכן, להוסיף דילול תרופות לתאי MEF ולהידגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 20%חמצן ו 5%פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון התרופה ולשטוף תאים עם 100 microliters של 1X PBS. כדי לגרום אלקליניזציה lysosomal, מראש לטפל בתאים עם 90 microliters של פתרון Bafilomycin A1, מדולל בינוני תרבות תאים טריים בריכוז סופי של 100 ננומולרים.

לאחר מכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 20% חמצן ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך שעה. לניתוח פלואורסצנטי של פעילות SA-beta-Gal, יש ליי לעשות פתרון עבודה טרי של C12FDG מדולל במדיום הצמיחה, בריכוז סופי של 100 מיקרומולרים. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של פתרון העבודה למדיום התרבות בריכוז סופי של 10 מיקרומולרים, ודגירה של תאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-20% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים.

לשטוף תאים עם 100 microliters של 1X PBS. לאחר מכן, להוסיף שני microliters של 100 מיקרוגרם למיליליטר Hoechst 33342 צבע בריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 20% חמצן, ו 5% פחמן דו חמצני במשך 20 דקות.

לאחר הדגירה, הסר את המדיה, הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה טרי, והמשך להדמיה. במחקר זה, פלטפורמת רכישה וניתוח של תמונות פלואורסצנטיות בתכנים גבוהים אפשרה זיהוי של תרופות סנוליטיות, כגון 17-DMAG, שהפחיתו את הפעילות הכוללת של SA-beta-Gal בתרבויות תאים פיברובלסט עובריות מורין המכילות תאים senescent במעבר חמש. ניתוחים כמותיים שנוצרו על ידי תוכנה של תערובות של תאים senescent ולא senescent לאפשר הדגמה ברורה של אפקטים ספציפיים לתא senescent, וחיסול של פעילות בטא גלקטוזידאז ברקע על ידי bafilomycin A.לוודא את כל פקדי התא הדרושים כלולים, במיוחד תאים senescent מטופלים ותאים senescent מטופלים עם שליטה חיובית.

מאמר זה כולל עבודה עם תאים ראשוניים תחת סטרס חמצוני, אשר יכול להוביל וריאציה כי צריך להיות במעקב. הליך זה הוא הצעד הראשון בזיהוי תרופות senotherapeutic. כדאי לבצע חיבורי כדאיות תאים וחושים נוספים כדי לאשר את תוצאות ההקרנה.

מספר תרופות סנוליטיות חדשות זוהו באמצעות מאמר זה, כולל שילוב התרופות הסנוליטיות הראשון dasatinib quercetin, חלבון הלם חום 90 מעכבי, מעכבי משפחת Bcl-2, ואת fisetin פוליפנול.