סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent
27 בספטמבר 2018
כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.
קרדיומיוציטים המופקים מגבעול פלוריפוטנטי המושרה או תאי IPS משמשים יותר ויותר כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות בתחום האלקטרופיזיולוגיה הלבבית. היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הם שהיא מאפשרת עלייה דרמטית בתפוקה, כמו גם הקלטות ספציפיות לפעולה תת-סוג בחדרי חדרים כמו מיוציטים, באמצעות אלמנט מקדם ספציפי חדרית. כניסתם של חיישני מתח מקודדים גנטית באמצעות התמרה lentiviral מאפשר הדמיה אופטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם נגזרים קרדיומיוציטים פוטנציאל פעולה.
התחל על ידי ערבוב lentivirus המכיל תרבות תאים על טבעי עם אמצעי תחזוקה cardiomyocyte, ביחס אחד לאחד. הוסף ברומיד hexadimetherine בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לשפר את יעילות הזיהום. ולהחליף את אמצעי התחזוקה cardiomyocyte בצלחת תרבות cardiomyocytes נגזר תא IPS, עם מדיום זיהום.
תרבות קרדיומיוציטים נגועים במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהחליף את מדיום הזיהום עם אמצעי תחזוקה קרדיומיוציטים טריים. לפני הדמיה, להחליף את מדיום תרבות התא עם הפתרון של טירודה, בתוספת סידן. לאחר מכן מניחים את הקרדיומיוציטים בתא הדמיה על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במפצל תמונה.
אם נדרש צעידה חשמלית, התקינו אלקטרודות צועדות בתא ההדמיה וחברו את האלקטרודות לגנרטור גירוי. הכניסו את התאים לפוקוס, ואתרו תא המבטא את מחוון המתח המקודד גנטית במרכז שדה הצפייה. הגדר את הנתיב האופטי כך שהאור הנפלט ינותב למפצל התמונה והחלק את קוביית המסנן במיקרוסקופ לנתיב שישולב עם המסננים במפצל התמונה.
בתוכנה השולטת במצלמה, הגדר את הגדרת הרכישה כך שניתן יהיה לבצע הדמיה במהירות גבוהה, והגדר את מפצל התמונה בהתאם להוראות היצרן. שתי התמונות המייצגות את שתי רצועות אורך הגל השונות של הפליטה צריכות להיות סמוכות זו לזה, כאשר כל אחת מהן תופסת מחצית אחת של התמונה. בדוק והתאם את מוקד התמונה המיוצרת על-ידי המצלמה לפי הצורך.
והתאימו את בהירות אור התאורה כך שתמנעו את רוויית הפיקסלים. הגדר את רכישת סדרת הזמן ועמעם את האור בחדר כדי למנוע אור תועה המשפיע על המדידה. לאחר מכן פתח את תריס אור העירור והתחל ברכישת סדרת התמונות, החל את ההליכה החשמלית בנקודת הזמן המתאימה, בהתאם לצורך ניסיוני.
לאחר סיום הרכישה, סגור את תריס אור העירור לפי הצורך ושמור את ההקלטה בכונן הקשיח. לאחר מכן, השארת הגדרת ההקלטה ללא שינוי, הקלט את הרקע מעל אזור של הכיסוי ללא תאים. לניתוח ההקלטות הפוטנציאליות של הממברנה האופטית, פתחו את ערימת ה-tiff המכילה את התאים ב- ImageJ, ולהשתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר אזור מעניין על פני קרדיומיוציט פלואורסצנטי, בערוץ האדום, תוך טיפול כך שהאזור גדול מספיק כדי שהתא לא יזוז מהאזור תוך כדי התכווצות.
לאחר מכן, בחרו 'נתח', 'כלים', 'מנהל אזור העניין' ובחרו 'הוסף T', כדי להוסיף את האזור כאזור עניין 1. גרור את אזור העניין מעל אותו תא בערוץ הירוק והוסף אזור זה כאזור עניין 2. בתפריטים 'נתח' ו'קבע מידות', בטלו את הבחירה בכל האפשרויות פרט לערך האפור הממוצע.
במנהל אזורי העניין, לחצו על 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'למדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. ייפתח חלון המכיל גיליון אלקטרוני עם שלוש השורות. השתמש ב'קובץ' ו'שמירה בשם' כדי לשמור את הגיליון האלקטרוני בקובץ ערך מופרד באמצעות פסיקים. סגור את החלון עם מחסנית התמונות וחלון הגיליון האלקטרוני מבלי לסגור את החלון Region of Interest Manager, ופתח את מחסנית ה- tiff המכילה את מדידת הרקע.
במנהל אזור העניין, לחצו על האפשרויות 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'מדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן שמור את נתוני הרקע בקובץ csv נפרד. כאן, נציג אחד IPS תא נגזר cardiomyocyte מתואר עם קווים מנוקדים לבנים המסמנים את אזורי העניין, שצוירו במהלך ניתוח ההדמיה בערוצי RFP ו- GFP מוצג. האות מערוץ RFP מדגים עלייה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנט במהלך כל פוטנציאל פעולה עקב העברת אנרגיה כפויה או תהודה גוברת הנגרמת על ידי שינויים בפוטנציאל הממברנה.
באופן קונקורדנטי, אות GFP מציג ירידה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנטיות. יחס RFP/GFP הוא האות הביולוגי המשמש בניתוחים במורד הזרם, כגון משך פעולה פוטנציאלי 50 ו -90 מדידות. לדוגמה, בשיטה זו, חדר בן 30 יום כמו קרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS שהונחו ב- 0.5 הרץ, הראה משך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 50 מתוך 439 אלפיות שניה, ומשך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 90 מתוך 520 אלפיות שניה.
גירוי חשמלי של הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS בשיעורי גירוי הולכים וגדלים כל חמש פעימות, הדגים קיצור הדרגתי של פוטנציאל הפעולה ככל ששיעור המכות עלה. יתר על כן, טיפול אגוניסט תאים נגזר IPS באופן ספונטני עם isoproternol, אגוניסט קולטן בטא adreno לא סלקטיבי, הוביל לעלייה מהירה בשיעור המכות, זה יכול להיות מוגבר עוד יותר עם מינונים הולכים וגדלים של אגוניסט. בעוד שיטה זו מספקת תפוקה מעולה בהשוואה למדידות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות, יש להיות מודעים למגבלותיה, כולל רזולוציה זמנית המוגבלת על ידי המאפיינים הקינטיים המהותיים של חיישן המתח הפלואורסצנטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג שיטה לדימות אופטי של פוטנציאלים פעולה בתאי שריר לב מסוג חדרי שמקורם בתאי גזע רב-עוצמיים שהושרה. הטכניקה משתמשת בחלבון פלואורסצנטי רגיש למתח שבא לידי ביטוי באמצעות גישה מונעת על ידי מקדם.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה של הלב
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות דימות אופטי
רקע
- תאי גזע רב-עוצמיים מושרה (IPS) משמשים להפקת תאי שריר לב.
- טכנולוגיה זו משפרת את התפוקה להקלטות פוטנציאל פעולה.
- אלמנטים של מקדם ספציפיים לחדר מאפשרים מחקרים ספציפיים לתת-סוג.
- חיישני מתח מקודדים גנטית מאפשרים דימות אופטי של פוטנציאלים פעולה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לדימות פוטנציאלים פעולה בתאי שריר לב.
- לשפר את ההבנה של האלקטרופיזיולוגיה הקרדיאלית.
- להשתמש בתאי שריר לב שמקורם ב-IPS ליישומים מחקריים.
שיטות ששימשו
- טרנסדוקציה לנטי-ויראלית להכנסת חיישני מתח מקודדים גנטית.
- ערבוב לנטי-וירוס עם מדיום תחזוקה של תאי שריר לב.
- שימוש בהקסדימתרין ברומיד להגברת יעילות הזיהום.
- החלפת מדיום התרבות במדיום זיהום עבור תאי שריר לב שמקורם ב-IPS.
תוצאות עיקריות
- דימות אופטי מוצלח של פוטנציאלים פעולה בתאי שריר לב.
- הוכחת תפוקה מוגברת למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
- איפשור רשומות ספציפיות לתת-סוג באמצעות ביטוי מונע על ידי מקדם.
- אימות השימוש בחיישנים מקודדים גנטית בדימות תאים חיים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב עוצמה לחקר האלקטרופיזיולוגיה הקרדיאלית.
- היא משפרת את ההבנה של פוטנציאלים פעולה בתאי שריר לב אנושיים.
- גישה זו יכולה להיישם על שאלות ביולוגיות שונות במחקר לב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Subtype-specific optical action potential recording in human iPSC-derived ventricular cardiomyocytes addresses a key challenge in cardiac safety pharmacology: phenotypic heterogeneity obscuring target engagement signals. By enabling ventricular-selective measurements, this method improves predictive confidence in early-stage electrophysiology screening and supports mechanistic de-risking of ion channel modulators. It positions ventricular-like iPSC-CMs as a disease-relevant system for lead identification and preclinical model validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in ventricular-like cardiomyocytes by isolating action potential signals from atrial/nodal contaminants.
- Operational Value: Supports biological de-risking of ion channel targets through promoter-driven, subtype-specific voltage sensor expression.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking optical readouts to ventricular-specific electrophysiological phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces ventricular-specific optical membrane potential recordings compatible with time-lapse fluorescence microscopy for compound screening.
- Quantitative Output: Enables action potential duration 50 and 90 measurements from RFP/GFP ratio changes, providing scalable electrophysiological endpoints.
- Reproducibility: Lentiviral transduction with ventricular promoter ensures consistent sensor expression across batches, supporting assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventricular-like iPSC-CMs model human ventricular electrophysiology, enabling translational biomarker alignment for arrhythmia risk assessment.
- Preclinical Continuity: Optical action potential recordings bridge discovery-phase target validation with preclinical safety evaluation of cardiac liabilities.
- Risk-Adjusted Advancement: Rate-dependent action potential shortening and isoproterenol response data support go/no-go decisions based on physiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical cardiotoxicity assessment, providing ventricular-specific electrophysiological readouts that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ventricular action potentials from mixed iPSC-CM populations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible optical signals with quantitative duration metrics for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates RFP/GFP ratio-based time series enabling action potential duration and rate-response analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects ventricular-specific optical recordings to preclinical continuity through human-relevant electrophysiological phenotypes.
- Enterprise Reuse: Lentiviral ventricular promoter construct establishes a reusable platform for subtype-specific cardiac electrophysiology screening across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity from phenotypic heterogeneity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of ventricular-specific optical recordings.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiac programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on ventricular-selective electrophysiological profiles.
Implementation Considerations
- Required expertise in lentiviral transduction, fluorescence microscopy, and iPSC-CM culture.
- Instrumentation needs include inverted epifluorescence microscope with image splitter and high-speed camera capability.
- Cross-team standardization requires consistent promoter-driven sensor expression and infection efficiency protocols.
- Adaptation considerations include promoter specificity validation across iPSC lines and differentiation batches.
- Practical limitations include temporal resolution constrained by fluorescent voltage sensor kinetics, as noted in source.
