חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה RNA על המנגנון והתפקוד של לוקליזציה RNA מקוטב. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של סחר RNA אנדוגני ברקמות חיות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול במחלות הקשורות RNA כי יש לו פוטנציאל לחשוף מטרות טיפוליות חדשות.

למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתהליכי RNA בתא הביצה זבוב פירות, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות כגון זברה או תאי תרבות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בגלל האתגרים הקשורים לעיצוב ומסירה של אביזרי משואה מולקולרית. עבור microinjection משואה מולקולרית, בחר את המטרה שמן 40X ולהוות כיסוי עם תא ביצה ניתוח על שלב המיקרוסקופ.

אתר תא ביצים בשלב ההתפתחותי הבינוני עד המאוחר המכוון כראוי למיקרו-ג'ינג'י. לאחר מכן להקים microinjector עם ההזרקה המתאימה ולחצים פיצוי. באמצעות ג'ויסטיק מיקרו מניפולטור, בעדינות להוריד מחט טעון עם מיקרוליטר אחד של פתרון משואה מולקולרית לתוך טיפת השמן.

הכניסו את הקצה לפוקוס לכיוון הפריפריה של שדה המבט. בצע פונקציה נקייה כדי להסיר את האוויר מן קצה המחט כדי להבטיח כי יש זרימה מן המחט ולהביא את המחט למצב הבית. התמקדו בתא הביצים כדי להיות microinjected ולהביא את המחט בחזרה לפוקוס ליד קצה תא הביצה.

בצע התאמה עדין של מיקום z של המטרה, כך הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק מן התאים האחות הוא בפוקוס. הכנס את המחט לתא אחות להזרקה של משואות מולקולריות על פני תקופה של שתיים עד חמש שניות. כדי להבטיח הצלחה microinjection לשחזור, להתמקד בזהירות על הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק ותאי האחות כי יוזרק תוך הבאת קצה המחט לפוקוס עם מניפולטור מיקרו.

כאשר כל המשואות המולקולריות הוזרקו, בעדינות להסיר את המחט ולחזור בו למצב הבית. שנה את המטרה להגדלה הרצויה לרכישת תמונה. לאחר מכן התמקדו בתא הביצים תחת המטרה החדשה והתחלו ברכישת התמונה.

לזיהוי ספוט של משואות מולקולריות, לפתוח את התמונות בתמונה J.Use להמיר לכלי ICY כדי להמיר את התמונות בחזרה ל- ICY. סרגל קנה מידה יגולל באופן אוטומטי על המחסנית. ערכו את סרגל קנה המידה דרך חלון המפקח לפי הצורך.

לאחר מכן בטלו את הפעלת סמל העין לסמל קנה המידה מתחת לטאב השכבה כדי להסיר את סרגל קנה המידה מהערימה המקורית. בחר איתור ומעקב, זיהוי וגלאי ספוט ואשר את זיהוי קלט הרצף הנוכחי ואפס ערוץ נבחרו עבור פרמטרי הקלט והעינווח המוקדם בהתאמה. לגלאי, בחרו 'זהה נקודה בהירה על רקע כהה' באמצעות שימוש בכוח באורכי גל תלת-מימדיים רק אם אין מספיק פרוסות z בערימות כדי לבצע את הניתוח.

בחרו סולמות ורגישות לכל קנה מידה והוסיפו סולמות נוספים לנקודות גדולות יותר ואשרו שאזור העניין מהרצף מוגדר לאזור עניין. לסינון, ודא שלא נקבע סינון ובחר בתבנית הקובץ המתאימה תחת פלט. אם יש להשתמש בתוצאות גלאי הספוט לניתוח מעקב, בחר ייצוא לבריכת שחייה.

לניתוח קולוקליזציה, חזור על זיהוי הספוט עבור הערוץ האחר. כדי לעקוב אחר נקודות המשואה המולקולרית, בחר איתור ומעקב, מעקב, מעקב אחר נקודות והפעל את גלאי הספוט באמצעות אותם פרמטרים כמו לגילוי הנקודה. לחץ על הערכת פרמטרים ובחר את תנועת היעד הרצויה בחלון המוקפץ של הערכת הפרמטרים.

לאחר מכן לחץ על הפעל מעקב. כדי להמחיש את הרצועות, בחר איתור ומעקב, מעקב ומעקב אחר מנהל. עבור מעבד רצועת צבע, בחר הפוך לזמין ובחר צבע עבור הרצועות.

מתוך הוספת מעבד מעקב, בחר עקוב אחר סרטון הזמן של המעבד. בחלון קוצץ הסימון, הזן את מספר הזיהויים שיוצגו לפני ואחרי נקודת הזמן הנוכחית. שמור את פרטי הרצועה כקובץ רצועת XML ולהשתמש בסמל המצלמה כדי להשיג צילום מסך של התוצאות.

כדי להקרין את המחסנית לאורך כיוון z, השתמש בסגל החיפוש כדי למצוא את התוסף ובחר הקרנה מרבית מהתפריט הנפתח. בחלון המפקח, בחרו בכרטיסייה, בד הציור והסיבוב של הרצף כדי להתאים את התמונה לכיוון הרצוי ולקבל צילום מסך של התמונה המסובבת. לאחר מכן בחרו אזור עניין, אזור עניין הדו-מימדי, בחרו צורת אזור עניין ובחרו את אזור העניין בתמונה לחיתוך.

התקן את תוסף שכבת-על של חותמת הזמן והוסף חותמת זמן בהתאם להוראות בחלון המוקפץ לקבלת הוראות כיצד למקם ולעצב את חותמת הזמן. כדי לשנות או להוסיף את מרווח הזמן, לחץ על ערוך בחלון מאפייני הרצף. הפעילו את סמל העין כדי להוסיף את סרגל קנה המידה מתחת לטאב השכבה בחלון המפקח.

לאחר מכן להשיג צילום מסך של התוצאות חותמות זמן ולשמור את התמונה בפורמטים TIFF ו- AVI. באמצעות שיטה זו כפי שהוכח, ניתן לדמיין את דפוסי התחבורה והלוקליזציה של mRNAs אנדוגני באמצעות משואות מולקולריות בשלבים שונים של oogenesis ובמיוחד ב- oogenesis באמצע ואחרי. כאשר מוזרק בנפרד לתוך תאים ביצה באותו שלב, משואות מולקולריות ספציפיות אוסקר שונים להציג את אותו דפוס של לוקליזציה.

משואות מולקולריות מוזרק לתוך הציטופלסמה של תא אחות יהיה להתפזר בחופשיות לתוך תאי אחות סמוכים, כמו גם לתוך oocyte. לכן, המשואות מסוגלים להכליל עם המטרות שלהם וליצור אותות פלואורסצנטיים באתרים אחרים מאשר באתר microinjection. בתאי ביצה מהונדסים GFP אוסקר באמצע oogenesis, ניתוח של נתוני הרכישה מראה colocalization נרחב עבור אות פלואורסצנטיות של GFP מהונדסים גנטית מתויג mRNA אוסקר עם אות פלואורסצנטיות זוהה באמצעות משואות מולקולריות.

יתר על כן, ערימות 5D ניתן לנתח עוד יותר כדי לקבוע מסלולי mRNA אוסקר עבור הובלה למרחקים ארוכים הן תא אחות ציטופלסמה oocyte. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור הובלת mRNA אימהית אנדוגנית ולוקליזציה בתא הביצים Drosophila.