Name: חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר ציימברס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למדו הדמיה בזמן אמת של mRNA בחיות Drosophila melanogaster באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ומאותות מולקולריים. שיטה זו חושפת מנגנוני לוקליזציה של RNA ומסייעת בזיהוי מטרות טיפוליות במחלות הקשורות ל-RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סלווטורה A.E. Marras (מרכז מחקר בריאות הציבור, באוניברסיטת רטגרס) לסינתזה, תיוג וטיהור של משואות מולקולרית, דניאל St ג'ונסטון (מכון גורדון, אוניברסיטת קיימברידג ') עבור אוסקר-MS2/ מניות לטיסה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס לאומי של קרן המדע בשנת 1149738 ופרס צוות מקצועי לקונגרס-CUNY ל DPB.

<ol><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li>
<li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li>
<li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5%27+to+3%27+degradation+and+trap+mRNA+decay+products%3A+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li>
<li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+probes+that+fluoresce+upon+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li>
<li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).</li>
<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
<li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li>
<li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li>
<li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97(2009).</li>
<li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+Oogenesis%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822(08)01196-2">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li>
<li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241(2009).</li>
<li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/04/03/294447.abstract">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).</li>
<li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li>
<li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li>
<li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li>
<li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons%3A+LNA%2F2%27-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).</li>
<li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגוד אינטרסים לגלות.

ויזואליזציה בשידור חי של סחר הנשים האנסוגני ב- Drosophila ילה תאי ביצה מסתמך על שימוש ספציפי, יעיל, ו nuclease עמידים לשימוש, אשר כעת ניתן לתכנן בקלות עם תוכנת pinmol . MBs הם רגשים ספציפיים שנועדו לזהות רצפים ייחודיים בתוך mRNA היעד (רצוי אזורים ללא מבנה משני), מה שמאפשר זיהוי מאוד מוחלט של תעתיק. המגבלה היחידה בעת אימוץ טכניקה זו/פרוטוקול עבור סוגים אחרים של רקמות/תאים הוא היעילות של משלוח MB עבור הדגימה של עניין. בעוד גישות אחרות דורשות מניפולציה גנטית של הרקמה כדי לבטא aptamer אלף ו-RNA מחייב חלבון ...

ביולוגיה של התא מחקרים להמחיש אירועים דינמיים עם רזולוציה מרחבית וזמני התאפשרה על ידי פיתוח של טכניקות הדמיה של תאים בעלי מבוססי-זריחה חי. כיום, ב vivo mrna הדמיה מושגת באמצעות טכנולוגיות המבוססות על rna aptamer-חלבון אינטראקציות, רנ א aptamer אלף המושרה של צבעים אורגניים וחומצה גרעין בדיקה ריפוי1,2, 3. כולם מציעים שיעור גבוה, רגישות ויחס אות לרקע. עם זאת, הגישות במרכז RNA aptamer-ממורכז דורשות מניפולציה גנטית נרחבת, שם מתוכנן לבטא רנ א עם מוטיבים מבניים מלאכותיים הדרושים עבור חלבון או מחייב צבע אורגני. לדוגמה, מערכת MS2/MCP מחייבת את הביטוי המשותף של הרשת המביעה מבנה RNA המכיל מספר חזרות דו-מושביים של רצף הכריכה עבור החלבון בקטביאג MS2 מעיל (MCP), והצפנה נוספת של חלבון פלורסנט . התמזגו ל-MCP4,5 התוספת של מוטיבים מבניים כגון ל-RNA, יחד עם חלבון מתויג מגושם, העלה חששות כי תהליכי RNA הילידים עשויים להיות מושפעים6. טכנולוגיה המטפלת בדאגה זו ומציעה יתרונות ייחודיים נוספים היא הגישה המבוססת על חומצות גרעין, משואות מולקולריות (MBs). MBs לאפשר זיהוי מולטידוגני של החומרים האנדוגניים, אפליה של נוקלאוטיד יחיד וריאציות, ו קינטיקה מהירה של הכלאה עם mrnas המטרה7,8. ב-MBs משתנים בדיקה שנותרו בקיפול מכופף לפני שעברו שינוי של fluorogenic ברגע שהם hybridize ליעדים שלהם (איור 1C)9. מספר קבוצות הצליחו להשתמש ב-MBs כדי לזהות שניהם rnas שאינם קידוד (מיקרורונאס ו-lncrnas)10,11,12,13, RNA רטרווירוסים14 ו-DNA דינאמי-חלבון אינטראקציות15. הם כבר מועסק בהצלחה עבור הדמיה באורגניזמים שונים ורקמות, כגון עוברי דג העוברים16, נוירונים13, רקמות הגידול17, ההבחנה הקרדיוציטים18, סלמונלה . בן 19
כאן אנו מתארים את העיצוב, המסירה ואת הגישה לגילוי עבור mRNAs האנדוגניים בחיים D. מלאנוגסטר חדרי ביצה בשילוב עם הגדרת מיקרוסקופ מספיק מהר כדי ללכוד את טווח דינמי של הובלה מולקולרית פעיל. תא ביצת D. melanogaster שימש מערכת המודל האידיאלי מרובת תאים עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים, מ-germline מוקדם גזע התא וביטוי גנים אימהית לדור של הגוף מגזרי20, . עשריםואחד תאי ביצה מבודדים בקלות, גדול שקוף, ומסוגל לעמוד שעות של ניתוח vivo ex , מה שהופך אותם קל מאוד ניסויים הדמיה. עבודה רבה התמקדה לוקליזציה אסימטרית של תעתיקים אימהי לאזורים בדידים משנה דיסקרטית לפני שהוא מתורגם באופן פעיל. במיוחד, לוקליזציה של אוסקר mrna ואת התרגום העוקב שלה בקוטב האחורי של oocyte חייב להתרחש בצורה מוסדר היטב כדי למנוע העובר הקטלני בלאודל היום22. אוסקר mrna משועתק בתאים 15 germline, שנקרא תאים האחות, ומועברים באופן פעיל דרך גשרים cytoplasmic, קרא תעלות הטבעת, לתוך oocyte, התא germline הופך ביצה בוגרת מופרית בסופו של דבר (איור 1a ). כמות ניכרת של מידע זמין כבר לגבי גיוס דינמי וחילופי חלבונים של גורמי חלבון מ- אוסקר mrnp, יחד עם נסיעות הארוך שלה תאיים שלה, להפוך את אוסקר למועמד המועדף ללמוד תהליכים רבים של מחזור החיים mRNA. MBs כבר אינסטרומנטלי לחשוף פרטים על תהליך הלוקליזציה של mRNA ופענוח הרגולציה והתפקוד של גורמי חלבון השולטים בתחבורה mRNA במהלך Drosophila ילה oogenesis. במיוחד, על ידי מיקרו הזרקת MBs לתוך התאים האחות וביצוע ניסויים הדמיה תא חי, המעקב אחר mrnas מעקב אפשרי8,23.
מפת הדרכים המוצגת כאן מציעה את השלבים של תהליך שלם, החל בביצוע ניסוי הדמיה של תא חי באמצעות MBs, רכישת נתוני הדמיה, כדי לבצע ניתוח נתונים כדי לעקוב אחר mRNA אנדוגניים בסביבה הסלולרית הטבעית שלה. השלבים יכולים להיות שונה וממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של חוקרים לעבוד עם רקמות אחרות/סוגי תאים בתוך הגדרת המעבדה שלהם.

<table><tbody><tr><td>ספקטרופלואורומטר</td><td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td><td>n/a</td><td>ספקטרופלואורומטר ספירת פוטונים</td></tr><tr><td>קוורץ קובט</td><td>Fireflysci (לשעבר Precision Cells Inc.)</td><td>701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 פינצטה</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>501985</td><td>פינצטה דקה חשובה מאוד להפרדת תאי הביצים הבודדים</td></tr><tr><td>שמן Halocarbon 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי מס' 1 22 מ"מ x 40 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CO2 כרית הרדמה של זבוב פירות</td><td>Genesee Scienific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td> <td>קונפוקלי דיסק מסתובבמיקרוסקופ הפוך Leica DMI-4000B מצויד בדיסק מסתובב Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD</td><td>Hamamatsu</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920000037</tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>920010504 מחט הזרקה: Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930000043</tr><tr><td>טיפ טעינה: 20 &mu; L Microloader</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>משקפי Micro Cover מס' 1 או 1.5, 22 מ"מ x 40 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>שמרים יבשים</td><td>כל חנות מכולת</td><td>ללא</td><td></td></tr><tr><td>מחשב, > 20 GB RAM</td><td></td><td></td><td>למרות שניתן לבצע עיבוד ברוב המחשבים, יכולות גבוהות יותר יגבירו את מהירות העיבוד</td></tr></tbody></table>

חזותי ומעקב אחר mrnas בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

שיטות הדמיה מבוססות-פלואורסצנטית, בשילוב עם התפתחויות במיקרוסקופיה קלה, יש מהפכה כיצד ביולוגים תא לנהל לימודי הדמיה של תאים חיים. שיטות זיהוי RNAs התרחבו מאוד מאז לימודי הזרע מקושרים לוקליזציה mRNA ספציפי לאתר לתקנות ביטוי גנים. תהליכי mRNA דינאמי יכול כעת להיות מדמיין באמצעות גישות המאתרות Mrna, בשילוב עם set-ups מיקרוסקופ כי הם מהירים מספיק כדי ללכוד את טווח דינמי של התנהגות מולקולרית. מסוגל לגילוי ישיר של תעתיקים. של התאים החיים משואות מולקולריות הן בצורת ראש, מנותת פנימי, יחיד-נוקלאוטיד להפלות בדיקה חומצות גרעין, אשר זרוח, רק על הכלאה לרצף יעד ייחודי. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מתקדם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הם מאפשרים אחד לבצע מעקב מרחבי וזמני של תנועה תאיים של mRNAs. למרות טכנולוגיה זו היא השיטה היחידה המסוגלת לזהות תעתיקים אנדוגניים, ביולוגים תא עדיין לא חיבק באופן מלא בטכנולוגיה זו בשל קשיים בעיצוב בדיקות כאלה עבור הדמיה תא חי. יישום תוכנה חדש, Pinmol, מאפשר עיצוב משופר ומהיר של הגששים המתאימים ביותר לhybridize ביעילות אזורים היעד mrna בתוך תא חי. בנוסף, ברזולוציה גבוהה, רכישת תמונה בזמן אמת, הנוכחי, ניתוח תמונה קוד פתוח תוכנה לאפשר פלט נתונים מעודן, המוביל הערכה עדינה יותר של המורכבות הבסיסית של תהליכים דינמיים המעורבים במחזור החיים של mRNA.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לעיצוב ושליחת משואות מולקולריות לתוך מלאנוזופרסטר תאי ביצה. הזיהוי וההדמיה הישירה והייחודית ביותר של מיקרו-האמדוגני מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ מסתובב הדיסק. נתוני הדמיה מעובדים ומנותח באמצעות זיהוי אובייקטים ומעקב בתוכנה קרח כדי לקבל פרטים על התנועה הדינמית של mRNAs, אשר מועברים ומקומי לאזורים מיוחדים בתוך oocyte.

באמצעות Pinmol, ניתן לתכנן מספר MBs עבור יעד mrna אחד (איור 1b-C). לאחר הסינתזה והטיהור, השימוש ב-MBs הנבחר מאופיין בניתוח חוץ-גופית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> איור 1: טכניקה ותיאור הרקמה עבור הדמיית תאים חיים של mRNAs האנדוגניים. (א) תיאור של חדר ביצה באמצע השלב של דרוזופילה</em...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה RNA על המנגנון והתפקוד של לוקליזציה RNA מקוטב. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של סחר RNA אנדוגני ברקמות חיות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול במחלות הקשורות RNA כי יש לו פוטנציאל לחשוף מטרות טיפוליות חדשות.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתהליכי RNA בתא הביצה זבוב פירות, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות כגון זברה או תאי תרבות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בגלל האתגרים הקשורים לעיצוב ומסירה של אביזרי משואה מולקולרית. עבור microinjection משואה מולקולרית, בחר את המטרה שמן 40X ולהוות כיסוי עם תא ביצה ניתוח על שלב המיקרוסקופ.אתר תא ביצים בשלב ההתפתחותי הבינוני עד המאוחר המכוון כראוי למיקרו-ג'ינג'י. לאחר מכן להקים microinjector עם ההזרקה המתאימה ולחצים פיצוי. באמצעות ג'ויסטיק מיקרו מניפולטור, בעדינות להוריד מחט טעון עם מיקרוליטר אחד של פתרון משואה מולקולרית לתוך טיפת השמן.הכניסו את הקצה לפוקוס לכיוון הפריפריה של שדה המבט. בצע פונקציה נקייה כדי להסיר את האוויר מן קצה המחט כדי להבטיח כי יש זרימה מן המחט ולהביא את המחט למצב הבית. התמקדו בתא הביצים כדי להיות microinjected ולהביא את המחט בחזרה לפוקוס ליד קצה תא הביצה.בצע התאמה עדין של מיקום z של המטרה, כך הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק מן התאים האחות הוא בפוקוס. הכנס את המחט לתא אחות להזרקה של משואות מולקולריות על פני תקופה של שתיים עד חמש שניות. כדי להבטיח הצלחה microinjection לשחזור, להתמקד בזהירות על הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק ותאי האחות כי יוזרק תוך הבאת קצה המחט לפוקוס עם מניפולטור מיקרו.כאשר כל המשואות המולקולריות הוזרקו, בעדינות להסיר את המחט ולחזור בו למצב הבית. שנה את המטרה להגדלה הרצויה לרכישת תמונה. לאחר מכן התמקדו בתא הביצים תחת המטרה החדשה והתחלו ברכישת התמונה.לזיהוי ספוט של משואות מולקולריות, לפתוח את התמונות בתמונה J.Use להמיר לכלי ICY כדי להמיר את התמונות בחזרה ל- ICY. סרגל קנה מידה יגולל באופן אוטומטי על המחסנית. ערכו את סרגל קנה המידה דרך חלון המפקח לפי הצורך.לאחר מכן בטלו את הפעלת סמל העין לסמל קנה המידה מתחת לטאב השכבה כדי להסיר את סרגל קנה המידה מהערימה המקורית. בחר איתור ומעקב, זיהוי וגלאי ספוט ואשר את זיהוי קלט הרצף הנוכחי ואפס ערוץ נבחרו עבור פרמטרי הקלט והעינווח המוקדם בהתאמה. לגלאי, בחרו 'זהה נקודה בהירה על רקע כהה' באמצעות שימוש בכוח באורכי גל תלת-מימדיים רק אם אין מספיק פרוסות z בערימות כדי לבצע את הניתוח.בחרו סולמות ורגישות לכל קנה מידה והוסיפו סולמות נוספים לנקודות גדולות יותר ואשרו שאזור העניין מהרצף מוגדר לאזור עניין. לסינון, ודא שלא נקבע סינון ובחר בתבנית הקובץ המתאימה תחת פלט. אם יש להשתמש בתוצאות גלאי הספוט לניתוח מעקב, בחר ייצוא לבריכת שחייה.לניתוח קולוקליזציה, חזור על זיהוי הספוט עבור הערוץ האחר. כדי לעקוב אחר נקודות המשואה המולקולרית, בחר איתור ומעקב, מעקב, מעקב אחר נקודות והפעל את גלאי הספוט באמצעות אותם פרמטרים כמו לגילוי הנקודה. לחץ על הערכת פרמטרים ובחר את תנועת היעד הרצויה בחלון המוקפץ של הערכת הפרמטרים.לאחר מכן לחץ על הפעל מעקב. כדי להמחיש את הרצועות, בחר איתור ומעקב, מעקב ומעקב אחר מנהל. עבור מעבד רצועת צבע, בחר הפוך לזמין ובחר צבע עבור הרצועות.מתוך הוספת מעבד מעקב, בחר עקוב אחר סרטון הזמן של המעבד. בחלון קוצץ הסימון, הזן את מספר הזיהויים שיוצגו לפני ואחרי נקודת הזמן הנוכחית. שמור את פרטי הרצועה כקובץ רצועת XML ולהשתמש בסמל המצלמה כדי להשיג צילום מסך של התוצאות.כדי להקרין את המחסנית לאורך כיוון z, השתמש בסגל החיפוש כדי למצוא את התוסף ובחר הקרנה מרבית מהתפריט הנפתח. בחלון המפקח, בחרו בכרטיסייה, בד הציור והסיבוב של הרצף כדי להתאים את התמונה לכיוון הרצוי ולקבל צילום מסך של התמונה המסובבת. לאחר מכן בחרו אזור עניין, אזור עניין הדו-מימדי, בחרו צורת אזור עניין ובחרו את אזור העניין בתמונה לחיתוך.התקן את תוסף שכבת-על של חותמת הזמן והוסף חותמת זמן בהתאם להוראות בחלון המוקפץ לקבלת הוראות כיצד למקם ולעצב את חותמת הזמן. כדי לשנות או להוסיף את מרווח הזמן, לחץ על ערוך בחלון מאפייני הרצף. הפעילו את סמל העין כדי להוסיף את סרגל קנה המידה מתחת לטאב השכבה בחלון המפקח.לאחר מכן להשיג צילום מסך של התוצאות חותמות זמן ולשמור את התמונה בפורמטים TIFF ו- AVI. באמצעות שיטה זו כפי שהוכח, ניתן לדמיין את דפוסי התחבורה והלוקליזציה של mRNAs אנדוגני באמצעות משואות מולקולריות בשלבים שונים של oogenesis ובמיוחד ב- oogenesis באמצע ואחרי. כאשר מוזרק בנפרד לתוך תאים ביצה באותו שלב, משואות מולקולריות ספציפיות אוסקר שונים להציג את אותו דפוס של לוקליזציה.משואות מולקולריות מוזרק לתוך הציטופלסמה של תא אחות יהיה להתפזר בחופשיות לתוך תאי אחות סמוכים, כמו גם לתוך oocyte. לכן, המשואות מסוגלים להכליל עם המטרות שלהם וליצור אותות פלואורסצנטיים באתרים אחרים מאשר באתר microinjection. בתאי ביצה מהונדסים GFP אוסקר באמצע oogenesis, ניתוח של נתוני הרכישה מראה colocalization נרחב עבור אות פלואורסצנטיות של GFP מהונדסים גנטית מתויג mRNA אוסקר עם אות פלואורסצנטיות זוהה באמצעות משואות מולקולריות.יתר על כן, ערימות 5D ניתן לנתח עוד יותר כדי לקבוע מסלולי mRNA אוסקר עבור הובלה למרחקים ארוכים הן תא אחות ציטופלסמה oocyte. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור הובלת mRNA אימהית אנדוגנית ולוקליזציה בתא הביצים Drosophila.

visualizing-tracking-endogenous-mrnas-live-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

בשל גודלם הגדול וארגונם הפשוט יחסית, תאי אחות דרוזופילה מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה של תאים חיים. סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תרכובות אקסוגניות לתוך התאים, והפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות הנקראות משואות מולקולריות (MBs) המשמשות להדמיית תעתיקי mRNA אנדוגניים.

מיקרו-הזרקה של תאי אחות דרוזופילה: שיטה להעברה תוך-תאית

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למדו הדמיה בזמן אמת של mRNA בחיות Drosophila melanogaster באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ומאותות מולקולריים. שיטה זו חושפת מנגנוני לוקליזציה של RNA ומסייעת בזיהוי מטרות טיפוליות במחלות הקשורות ל-RNA.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

גלה סרטונים נוספים