ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

הבדלים בתרבות 2D פשוטה במבחנה לעומת סביבות כמו רקמות תלת-מימדיות הגבירו את העניין במערכות תלת-מימדיות כדי לייצג את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות מחיה. תהליך הייצור אינו דורש טכניקות מתקן או פוטוליטוגרפיה. עם זאת, התקן PDMS תלת-מימדי כולל את הווקטורים הדרושים עבור יישומי סביבה פיזיולוגית תלת-מימדית.

להכנת מכשיר mesofluidic, להשתמש בתוכנת עיצוב תלת מימדית מתאימה בעזרת מחשב כדי לתכנן את המסכה של התבנית עבור התקן polydimethylsiloxane או PDMS ולהדפיס את התבנית באמצעות ציוד ליטוגרפיה סטריאו עם שרף thermoresistant. כאשר התבנית מוכנה, בערך לערבב שלושה מיליליטר של פתרון מונומר PDMS לכל עובש עם סוכן ריפוי ביחס של 10 לאחד ולהשתמש ואקום כדי degas את התערובת ב desiccator ואקום במשך שעה אחת. בסוף ההתבולל, השתמש בחתיכת סרט הדבקה כדי להסיר אבק מפני השטח של התבנית ולמלא בזהירות את התבנית בתסיכת PDMS מנומקת.

לאחר מכן, לרפא את PDMS ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפני המאפשר את התבנית להתקרר בטמפרטורת החדר. כאשר התבנית מקוררת למגע, השתמש בלהב כדי לחתוך את הגבול בין התבנית ל- PDMS ולקלף בזהירות את ה- PDMS מהתבנית. חתוך את ה-PDMS כך שיתאים לכיסוי של 22 על 22 מילימטרים ויגרום לחור בהיכנסה.

באמצעות רקמות מוך נמוך ו 70%אתנול, לנגב את המכשיר מכסה ולטבול את המכשיר עם חתיכה חדשה של סרט דבק כדי להסיר את כל חלקיקי אבק גדולים. לאחר מכן, סגרו אוטומטית את מכשיר ה-PDMS וכיסויים ב-121 מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות רטובות ו-15 דקות יבשות וטפלו במשטח התחתון של חלק ה-PDMS ומכסים אותו באקדח פריקה קורונה במשך חמש דקות במכסה המנוע של תרבות הרקמה לפני חיבור החלקים יחד. כדי לטעון את המכשיר, תחילה להשתמש מחדש את התאים של עניין בנפח מתאים של מדיום צמיחה בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין ו 1%אינסולין-transferrin-סלניום-x.

הבא לערבב 50 microliters של ההשעיה תא בלוטת החלב עם 425 microliters של פתרון קולגן מנוטרל מוכן טרי ולמלא פיפית 200 microliter עם המתלה תא קולגן. הזרק את ההשעיה דרך הכניסה לתוך מכשיר PDMS עד התא כולו מתמלא למקם את המכשיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת כדי לגרום ג'לציה לפני מילוי המאגרים משני הצדדים עם מדיום צמיחה ולהחזיר את המכשיר לאינקובטור עד הדמיה confocal. להדמיה תלת מימדית וכימות, התקינו תא תרבות הדמיה של תאים חיים על מיקרוסקופ קונפוקלי וקדו מראש את הטמפרטורה והפחמן הדו-חמצני ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% בהתאמה.

מוסיפים מים למאגר תא ההדמיה כדי לחות את התא, מניחים מגבונים לחים בתא לפי הצורך ומניחים את מכשיר ה- PDMS בתא. הוסף גורם גדילה אפידרמיס לאחד המאגרים כמקור של הגורם היווצרות הדרגתית עוזב את המאגר השני לשמש כיור לפיתוח התפלגות גורם הגדילה אפידרמיס מדורג מרחבית. לאחר מכן הגדר את הטווח של מחסנית Z המכסה את נפח האורגנואידים של עניין ולהתחיל את ההדמיה.

בסוף הניסוי, השתמש בתוכנית ניתוח תמונה מתאימה כדי למדוד את האורך והזווית של הענפים המשתרעים מן האורגנואידים או הגירה של תאים בודדים. הן בבדיקות סיליקו והן במבחנה חשפו היווצרות של שיפוע גורם גדילה אפידרמלי ליניארי יציב על פני אזור תרבות התאים הנמשך כיומיים ללא חידוש מאגרי המקור או הכיור המצביעים על כך שגורם הגדילה האפידרמלי, חלבון 6.4 קילודלטון, יכול ליצור שיפוע יציב המבוסס על דיפוזיה בתוך ג'ל קולגן שהוכן כפי שהוכח על פני תקופה קצרה יחסית של זמן. אורגנואידים ממאריים יוצרים ענפים מרובים בנוכחות גורם גדילה אפידרמלי 2.5 ננו-מולארי אחיד באופן מרחבי ללא הטיה כיוונית במשך שלושה ימים אם גורם הגדילה האפידרמלי מתווסף שיפוע ליניארי יש 0.5 nanomolar למיליליטר.

עם זאת, היווצרות הענף מציגה הטיה כיוונית משמעותית. שימו לב, התוספת של מעכבי צומת פער מדכאת את היכולת של האורגנואידים להגיב לשיפוע. ה- pH של פתרון קולגן הוא קריטי עבור gelation ואת הכדאיות התא.

אם הקולגן אינו מנוטרל לפני הערבוב, הכדאיות של התא תהיה נמוכה. שיטה זו ניתן להאריך כדי להתאים מידול רקמות מציאותי יותר יכול להכיל היווצרות רשת כלי דם מתאים בודדים בתוך הג'ל.