במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

שיטה זו לוכדת אינטראקציות חלבון חולף באורגניזמים כמו חיידקים ושמרים ובסוגי תאים שונים. כאן אנו מנטרים מתחמי מלווים ספציפיים שנוצרו באופן ארעי ומעורבים בפרוטאוסטאזיס תאי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מידע על דינמיקה לוקליזציה תת תאית של מכלי חלבון בתאים פרוקריוטיים ואיקריוטיים.

התאמות של טכניקה זו באורגניזמים יוניקולריים כמו חיידקים ושמרים, מאפשר לחוקרים להשתמש בו ככלי רב עוצמה לחקור מחלות הקשורות לזיהומים מיקרוביאליים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת באופן פוטנציאלי כדי לנתח אינטראקציות חלבון כמעט בכל האורגניזמים פשוט על ידי שינוי התנאים בשלב הכנת המדגם של הפרוטוקול. חשוב לבחור נוגדנים באיכות טובה שהם ספציפיים ונבדקים באימונוהיסטוכימיה, שפעת חיסונית, ELISA או immunoprecipitations.

התחל בטיפול מקדים בשקופיות אבחון של 10 בארות עם פולי-ל-לינזין. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סטרילי ומסונן 0.0001%poly-L-Lysine לכל באר, והדרוגו את השקופיות במשך 30 דקות במכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 50 microliters של מים סטריליים כדי להסיר עודף פולי-L-לינזין.

מוסיפים כ-15,000 תאים ל הבאר בהתאם לסוג התא, ומגדלים את התאים באינקובטור לח סטרילי ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו-חמצני ל-60%-80%. לאחר 24 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה על ידי הצבת נייר טישו בקצה של כל באר, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 50 microliters של PBS. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 50 microliters של טרי מוכן 4% paraformaldehyde ב PBS לכל באר דגירה השקופית בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

לאחר קיבעון, לשטוף את השקופית שלוש פעמים על ידי שקוע את השקופית בצנצנת מכתים שקופיות עם PBS. כדי לחלחל את הממברנות של התאים המחוברים, להטביע את השקופית ב 100 מיליליטר של 0.5% טריטון-X100 ב PBS, ודגירה את התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב TBS-T.

לאחר הכביסה האחרונה, להסיר חיץ עודף עם נייר טישו. לגדל ולדלל תאים S.cerevisiae על פי הוראות כתב היד, ולאחר מכן להעביר אותם צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר גלולה על ידי צנטריפוגה ב 665 פעמים g במשך שלוש דקות. הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים בחמישה מיליליטר של מדיום טרי.

לאחר מכן הוסיפו 550 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד לריכוז סופי של 4% והדגירה את התרבות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר הדגירה, גלולה את התאים, להסיר את supernatant, ולתלות את גלולה במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde מוכן טרי במאגר לשטוף. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.

בינתיים, הכינו את שקופיות האבחון על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של 0.0001%poly-L-Lysine לכל באר ודגירה של השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הפולי-ל-ליזין העודף במים אולטרה-חמים ותנו לשקופיות להתייבש באוויר. לאחר שלב הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף על ידי צנטריפוגה.

הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במאגר הכביסה. גלולה את התאים לאחר הכביסה האחרונה, ולהסיר את supernatant ולתלות את התאים במיליליטר אחד של חיץ לשטוף המכיל 1.2 סורביטול טוחן. כדי לעכל את קיר התא, גלולה התאים שוב resuspend התאים ב 250 microliters של פתרון Lyticase מוכן טרי.

דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם רעידות עדינות. לאחר שלב העיכול, לשטוף את התאים שלוש פעמים במאגר לשטוף מחדש את התאים ב 250 microliters של חיץ לשטוף המכיל 1.2 סורביטול טוחן. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש לכל באר מצופה פולי-ל-לי לסין, ואפשרו לתאים הקבועים והמחלחלים להתחבר במשך 30 דקות.

לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 50 microliters של חיץ לשטוף כדי להסיר תאים שאינם חסידים, ולהמשיך עם בדיקה רצועות הקרבה. ליזום את מוצג רצועות הקרבה, או פרוטוקול PLA, על ידי הוספת טיפה של מאגר החסימה לכל באר ולהדגיר את השקופית בתא לח במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את חיץ החסימה על ידי הצבת נייר טישו בקצה כל באר, ולשטוף את התאים פעמיים ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף A.Next, להוסיף 40 microliters של פתרון הנוגדנים העיקרי לכל באר, ולהדגיר את השקופית במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח.

הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטף את השקופיות פעמיים במאגר הכביסה A.לאחר הכביסה, הוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני לכל באר והדגירה את המגלשה במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. לאחר מכן להסיר את הפתרון ולשטוף את השקופיות פעמיים במאגר לשטוף A.Then להוסיף 40 microliters של תערובת רצועות DNA המכיל את המחבר oligonucleotides ו LIGASE DNA, לכל באר, ולהדגיר את השקופית בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את תערובת הקשירה ולשטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף A.Add 40 microliters של תערובת הגברה DNA המכיל את פולימראז DNA ואת oligonucleotides שכותרתו פלואורסצנטי לכל באר, ודגירה במשך 100 דקות בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס.

הסר את תערובת ההגברה ולשטוף את השקופיות ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף B במשך 10 דקות לכל לשטוף. לאחר מכן לשטוף את המגלשות ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף B מדולל אחד עד 100 במים אולטרה. הוסף 20 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה המכיל DAPI לכל באר.

מכסים את בארות השקופית עם תלוש כיסוי וחותמים בלק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לניטור הרכבות מלווים ארעיות שנוצרו בין חלבונים ייחודיים של J-domain לבין חלבונים מלווים ו- J-domain בתאי HeLa, S.cerevisiae ו- E.coli. חלבונים ברמה אנושית מסוג A ו-B J-domain היו ממוקדים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים ביותר.

כל אחד מהנקבים הפלואורסצנטיים האדומים מייצג קומפלקס חלבונים שנוצר בין שני חלבונים ייחודיים של J-domain בתאי HeLa. קומפלקסים דומים של חלבון J-domain מסוג מעורב נצפו גם באוקריוטה S.cerevisiae חד-תאי, או בשמרים של אופה. חלק מהנקבים הפלואורסצנטיים שנוצרו מ- PLA היו קשים יותר לפתרון כמוקדים בודדים, בשל גודל התא הקטן.

היווצרות מורכבת בין חלבונים מסוג A ו- B J-domain לא נצפו בתאי E.coli, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים ביוכימיים שבוצעו עם חלבונים מטוהרים. אבל הרכבות מלווים אחרות שכללו חלבונים של ג'יי-דומיין והמלווה של Hsp70 נתפסו באמצעות פרוטוקול PLA. בקרות טכניות חסרות נוגדן ראשוני נגד אחד החלבונים או המלווים של J-domain המתקיימים בתגובות PLA שלמות אחרת הראו היווצרות פנצ'יטי פלואורסצנטי מועטה או ללא דו-חושית בתאים, מה שמצביע על היעדר הגברה שגויה של אותות חיוביים.

כדי להשיג תוצאות אמינות באמצעות בדיקת רצועות הקרבה, ודא מראש כי הנוגדנים המשמשים הם באיכות מספקת. יתר על כן, לנקוט אמצעי זהירות במניעת עיכול יתר של תאים המכילים קיר התא.