ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC
9 במאי 2020
הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.
ניתן להשתמש ב-CRAC קינטי כדי לחקור קשרים זמניים בין RNA וחלבונים קושרי RNA בטווח זמן קצר חסר תקדים. בשילוב עם הקישור הצולב שלנו, CRAC קינטי מסוגל להצליב תאים חיים תוך שניות. זה מפחית את תגובות נזקי ה-UV ומקל על חקר תגובות הלחץ ברזולוציה בקנה מידה זעיר.
CRAC קינטי הוא פרוטוקול ארוך מאוד שיכול להיות מאתגר עבור משתמשים חדשים. בנוסף, עבודה עם RNA מציבה אתגרים משלה. כדי למנוע פירוק RNA, יש לסנן לעקר את כל התמיסות ולוודא שהפיפטות וספסל המעבדה נשמרים נקיים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שחלק מהשלבים אינם אינטואיטיביים במיוחד. זה כולל קישור צולב UV וקצירת תאים, כמו גם מיצוי RNA צולב מהג'ל. כדי לבצע קישור צולב UV על מיקרואורגניזמים בתמיסה, יש לחסן 3.5 ליטר מהמדיום הרצוי עם שמרים ל-OD התחלתי של 600 של 0.05, ולגדל את התרבית בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור רציף ב-180 סל"ד.
לאחר שהתאים מגיעים ל-OD הרצוי, שפכו 500 מיליליטר מהתרבית היישר לתוך ה-Vari-X-linker והקרינו אותו ב-250 מיליג'אול של 254 ננומטר UV. לאחר הצלבה, השתמש במכשיר סינון ואקום כדי לסנן את התאים. מגלגלים את הממברנה עם התאים המסוננים, ומניחים אותה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר שכותרתו T0. מסננים את התאים הנותרים על פני שישה מסננים שונים, וזורקים את הממברנות בשלושה ליטרים של מדיום מעורר מתח שחומם מראש, ומערבבים אותם במרץ עם פיפטה למשך 50 שניות. המשך להצליב את התאים בנפחים של 500 מיליליטר בנקודות הזמן הרצויות, ולאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להצליב תאים דבקים, העבירו את צלחת תרבית הקוורץ עם התאים למגש המתמחה, והקרינו אותה ב-300 מילי-ג'אול של 254 ננומטר UV. מניחים מיד את המנה על קרח. מוציאים את מצע הגידול מהצלחת ומוסיפים 10 מיליליטר PBS קר כקרח. אוספים את התאים על ידי גירוד, ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
לאחר מכן גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת התאים עם PBS, הסר את ה-PBS והקפיא את כדור התא על קרח יבש. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפי הצורך.
כוונו את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס, והכינו שתי שורות של צינורות של 1.5 מיליליטר לדגימה לפליטה. סובב במהירות את העמודים עם חרוזי הניקל כדי להיפטר מנפח הריק. לאחר מכן הניחו את העמודים בשורה הראשונה של צינורות הפליטה, ומלאו אותם ב -200 מיקרוליטר של מאגר פליטה.
לאחר שתי דקות, סובב במהירות את העמודים והעביר אותם לשורת הצינורות השנייה. לאחר מכן חזור על הפליטה כפי שהודגם קודם לכן. בסיום, שלב את כל הפליטות בצינור של חמישה מיליליטר, והוסף שני מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר גליקוגן.
לאחר מכן הוסיפו לדגימה 100 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית, ומערבלו אותה למשך 30 שניות. לאחר שטיפת הדגימה באצטון, השעו אותה מחדש ב -30 מיקרוליטר של מאגר טעינת חלבון. לאחר מכן, בדוק את הרדיואקטיביות באמצעות מונה גייגר.
מחממים את הדגימה במשך 10 דקות בחום של 65 מעלות צלזיוס, ומעמיסים אותה על ג'ל ביס-טריס יצוק מראש של מילימטר אחד של ארבעה עד 12%. הפעל את הג'ל למשך 90 דקות ב-125 וולט במאגר MOPS. בסיום, עטפו את הג'ל בניילון נצמד, ואבטחו אותו לחלק הפנימי של קלטת אטומה קלה בעזרת סרט.
לאחר חשיפת הג'ל לסרט הרדיוגרפי האוטומטי, פתח את הסרט על ידי חיתוך הניילון הנצמד המכסה את הג'ל, הקפד לא להזיז את הג'ל ולקזז את התמונה. הניחו את הסרט מעל הג'ל, והוציאו את הרצועה המעניינת. הכניסו את פרוסת הג'ל לצינור של שני מיליליטר, ומעכו אותה בעזרת קצה פיפטה P1000.
לאחר מכן הוסף מאגר פרוטאינאז K ופרוטאינאז K.דגרו את הדגימה ב-55 מעלות צלזיוס בניעור נמרץ. הפעל את ה-cDNA על ג'ל טרומי של 6% TBE ב-100 וולט למשך שעה, באמצעות סולם מתאים לכימות מקטעי DNA קצרים. בסיום, הניחו את הג'ל בכלי אטום לנוזל עם מספיק TBE כדי לכסות אותו, והוסיפו כמות מתאימה של צבע SYBR Safe.
מכתימים את הג'ל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן החלף את המאגר המכיל SYBR ב-TBE טרי. שוטפים את הג'ל למשך 10 דקות בניעור עדין.
מסננים את ה-TBE ומניחים את הג'ל בתיקייה שקופה. גזרו את התיקייה לגודל מתאים, ודמיינו את הג'ל עם כמות תמונה. הוציאו את שברי ה-DNA בין 175 ל-400 זוגות בסיסים, והכניסו את חתיכת הג'ל לשפופרת של 1.5 מיליליטר.
מרסקים את הג'ל עם קצה פיפטה P1000, ומוסיפים 400 מיקרוליטר מים. לאחר מכן דגרו אותו למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול. הקפיאו את הדגימה על קרח יבש למשך 10 דקות.
לאחר מכן חזור על הדגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הכנס שני מסנני מיקרופייבר זכוכית בתוך עמוד פילטר המונח בצינור. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה P1000 חתוך כדי להעביר את מתלה הג'ל TBE ליחידת המסנן וסובב אותו ב-17,000 גרם למשך 30 שניות.
פרוטוקול זה שימש לניטור אינטראקציות Nrd1-RNA בתאי שמרים הנתונים לסביבה רעבה לגלוקוז. הדגימות הוצלבו לפני המעבר לבינוני ללא גלוקוז, כמו גם אחת, שתיים, ארבע, שמונה, 14 ו-20 דקות לאחר מכן. האוטו-רדיוגרפים מהניסוי הראו אות עז במשקל המולקולרי הצפוי של Nrd1, המייצג את החלבון הקשור ל-RNA קצר המסומן ברדיו שאינו ניתן לריצוף.
האות מעל פס זה, שהוא החלבון המקושר לשברי RNA ארוכים יותר, בודד. כדי לתקן את פרוטוקול ה-CRAC הקינטי לתאי יונקים, פותח שלב מיוחד המאפשר הקרנת UV של כלים עם תאים נצמדים. היעילות של הגדרה זו נמדדה באמצעות קישור צולב ולכידת GFP RBM7 מתויג ביציבות.
הצלב הצליח לשחזר קומפלקסים של RNA חלבוני מתאי יונקים באמצעות קרינת UV של 254 ננומטר ביעילות דומה למכשיר קרינת UV בשימוש נרחב. פיתוח צלחת פטרי קוורץ חדירה ל-UV במהלך קישור צולב שיפר עוד יותר את ההתאוששות של קומפלקסים של RNA חלבוני. נתוני Nrd1 מראים שהחלבון נקשר לתעתיקי RNA רבים שאינם מקודדים, מה שמצביע על כך שהוא מעורב בפירוק של תעתיקים אלה.
הודגמה גם קשירה לתעתיקים המקודדים HXT6 ו-HXT7, שניהם מווסתים במהלך רעב גלוקוז. CRAC קינטי מאפשר למדוד את האינטראקציות הדינמיות בין RNA חלבונים במהלך התפתחות התא, תגובות מתח והרכבה של קומפלקסים מקרומולקולריים, כגון הריבוזום או הספלייסוזום.
סקירה כללית
קישור צולב קינטי וניתוח של cDNA (Kinetic CRAC) היא שיטה לחקר אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA בתאים חיים ברזולוציה זמןית גבוהה. פרוטוקול זה מפרט את השלבים עבור גידול תאי שמרים, קישור צולב באמצעות UV, קציר, טיהור חלבונים והכנת ספרייה לרצף דור הבא (NGS).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- שיטת Kinetic CRAC מאפשרת לחקור קשרים זמניים בין RNA לבין חלבונים קושר-RNA.
- השיטה מזכירה לתגובות של נזקי UV, ובכך משפרת את מחקרי התגובה למעמ (stress response).
- האתגרים כוללים פירוק של RNA ואת מורכבות הפרוטוקול.
- הדגמות ויזואליות הן קריטיות להבנת השיטה.
מטרת המחקר
- לחקירת אינטראקציות בין חלבונים ל-RNA בתאים חיים.
- לספק פרוטוקול מפורט ל-Kinetic CRAC.
- לשיפור יעילות הקישור הצלב (crosslinking) בתאי יונקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול תרבית שמרים וקישור צלב (cross-linking) באמצעות UV.
- קציר תאים ומיצוי RNA.
- טיהור חלבונים באמצעות חרוזי ניקל.
- הכנת ספרייה לרצף דור הבא (Next-generation sequencing).
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של אינטראקציות Nrd1-RNA בשמרים.
- פיתוח של צלחת פטרי מקוורץ חדירה ל-UV עבור תאים של יונקים.
- השגה יעילה של קומפלקסים של חלבון-RNA באמצעות המערך החדש.
- אותות עזים שנצפו במשקלים מולקולריים צפויים באוטורדיוגרפים.
מסקנות
- Kinetic CRAC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות של RNA.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לסוגי תאים שונים.
- עזרים חזותיים וטיפול זהיר חיוניים להצלחת התהליך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ניטור ברזולוציה גבוהה של דינמיקת אינטראקציה בין חלבונים ל-RNA הוא קריטי להורדת סיכונים בתהליך תיקוף המטרה ולהבנת מנגנוני בקרה בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול ה-χCRAC מאפשר מיפוי זמני מדויק של קישורי חלבוני קישור ל-RNA בתאים חיים, ובכך תומך בביטחון ניבוי בעת חקירת מסלולים ביולוגיים. יכולת זו מסייעת בקבלת החלטות לגבי תיק הפיתוח על ידי הבהרת תפקידים מנגנוניים במהלך עקה תאית והתפתחות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של אינטראקציות דינמיות בין RBP ל-RNA בתנאים פיזיולוגיים ובתנאי עקה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת קומפלקסים רגולטוריים חולפים ותזמון היווצרותם.
- משפר את רמת הביטחון החזויה בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי לכידה של אירועי קישור בזמן אמת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקל על הכנת מערכות ביולוגיות עובדות (validated) עבור סריקה המשכית של מודולטורים.
- מספק קריאות כמותיות ורזולוציית זמן לצורך סטנדרטיזציה והשחזרה של הבדיקה.
- מאפשר הערכה חסונה של השפעות תרכובות על דינמיקת RBP-RNA במספר נקודות זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים של סטרס הרלוונטיים למחלה על ידי לכידה של תגובות מולקולריות מהירות in vivo.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מיפוי של רשתות רגולטוריות לאורך זמן.
- מספק מידע לקידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי אינטראקציות RNA-protein תלויות-הקשר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת χCRAC משתלבת ברצף הפיתוח משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין RNA לחלבון במהלך הפרעות תאיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מספקת נתונים זמניים לבדיקת השערות והבהרת מסלולים בתאים חיים.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור להערכת השפעת תרכובות על קומפלקסים של RBP-RNA.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות מבוססות ריצוף וקריאות אוטורדיוגרפיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תובנות מכניסטיות למודלים של מחלות על ידי לכידת שינויים רגולטוריים המושרים על ידי סטרס.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למערכות שמרים ויונקים עבור תוכניות מו"פ מגוונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בעלות רזולוציה זמנית גבוהה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הבהרה של מנגנוני בקרה דינמיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA ובטכניקות קישור צולב (crosslinking) למניעת פירוק.
- מחייב מכשור ייעודי להקרנת UV ולקצירת תאים לצורך השגת יעילות גבוהה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להבטחת עיבוד וניתוח דגימות הניתנים לשחזור.
- ניתן להתאמה למודלים של שמרים ושל יונקים באמצעות שינויים מתאימים בחומרה.
- מורכבות הפרוטוקול ויציבות ה-RNA מהוות מגבלות מעשיות הדורשות הכשרה קפדנית ובקרות.
