פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקירת הפצה ולוקליזציה של חלבונים והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים שיטה מעשית המשפרת באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ומפרטת את השיטות שלנו להיסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה והכלאה פנימית.

לפני השלבים המוצגים כאן, יש לשטוף שקופיות בחומר ניקוי, ולאחר מכן לשטוף במי ברז ומים מזוקקים לפני שהוכנסו לתנור לייבוש. שקופיות יבשות צריך בעדינות להשרות אשלגן dichromate במשך 24 שעות לפני שטף מיובש שוב, ולאחר מכן להציב 95% אתנול במשך שעתיים לפחות. במהלך שלב זה, אתה יכול להכין שקופיות נוספות או אלום כרום-ג'לטין על פי השיטות שלנו.

לאחר מכן ניתן לאחסן ג'לטין במי אמבטיה של 60 מעלות לפני השימוש. כדי לצפות שקופיות, יש להניח כמות קטנה של ג'לטין על קצה אחד של השקופית. לאחר מכן השתמש במגלשת זכוכית נוספת כדי לגרור באיטיות ובאופן שווה את הג'לטין על פני השטח של השקופית כדי להיות מצופה.

זה יוצר שכבה דקה ואחידת. לפני לשים בארון תקשורת או מנגנון ייבוש להיות מאוחסן בתנור כדי לאפשר ייבוש מלא במשך לילה אחר או 48 שעות. העובר נאספים באמצעות צלחת אגר מיץ ענבים, פעם מוכן, צלחת אגר מיץ ענבים לאחר מכן ניתן להסיר.

מציפים את הצלחת ב-PBS ומברישים בעדינות עם מברשת רכה כדי להסיר את כל העוברים המצורפים. הסר עובר המכיל PBS לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאפשר לנוח על קרח. לאחר העובר הם התיישבו על קרח, בעדינות להסיר את PBS supernatant.

היזהר לא להפריע לעובר בתחתית הצינור. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אקונומיקה לדגימה ומנערים בעדינות במשך שתי דקות. הסר את האקונומיקה על ידי סינון ולשטוף עוברים ב- PBS שלוש פעמים.

הכן n-heptane. ברגע שהם מוכנים, שטפו את העוברים מנייר הסינון לתוך n-heptane על ידי ניעור נייר הסינון בעדינות בתמיסה. אפשר לעוברים להתיישב בתחתית צלחת n-heptane ולאסוף את זה n-heptane לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של מתנול לצינור, לאפשר את הפתרון לזרז ולאחר מכן לשאוף את מתנול n-heptane. לשטוף את העובר ב PBS שלוש עד חמש פעמים כדי להסיר מתנול שיורית. הסר PBS נוסף זה ולהוסיף את Bouin של fixative ולאפשר להסתפק במשך 30 עד 60 דקות על מנת לתקן את העוברים.

הסירו את הקיבוע של בוין ושטפו שוב את העוברים ב-PBS שלוש פעמים. הכן 1.2% agarose ב- PBS ולשמור על חום באמבט מים 60 מעלות ולאחר מכן להכין את העוברים להטמעה על ידי שאיפה עדינה PBS נוסף כי זה כבר מאוחסן. היזהר לא להפריע לעוברים בתחתית, ולאחר מכן לשאוף את תקע העובר בתחתית הפתרון ומניחים בעדינות לתוך תבנית פקק בקבוק.

שאפו כל PBS נוסף מתבנית זו לפני הוספת 1.2% ג'ל agarose. הכן פתרון של PBS כדי לאחסן תקעים אלה agarose. לאחר התגבשות האגרווז, תקעים בודדים לאחר מכן ניתן להעביר לתוך PBS זה לאחסון.

כאן אנו מראים את תהליך התייבשות רציף. מאפשר 15 דקות לדגירה בכל פעם. לאחר מכן להסיר מן 100% אתנול ולתקן בתמיסה אחד על אחד של אתנול וקסילן במשך 15 דקות נוספות.

לאחר הסרת פתרון זה אחד על אחד, להסיר קסילן טהור במשך דקה אחת. עכשיו דגימת הרקמה מוכנה להעברה לתמיסת פרפין קסילן מחוממת של אחד על אחד. אפשר לשבת 30 דקות לפני ההטבעה הסופית ב-100% פרפין.

עבור לראשון של 100% פרפין ולנוח במשך שעתיים. חזור על תהליך זה בשניים ושלושת הפרפינים שלו. המדגם מוכן כעת להעברה לתבנית ולתבנית המלאה בשעווה כדי להשלים את תהליך ההטבעה.

הטמעה של עוברים דרוזופילה. מניחים חלקי פרפין מוכנים של עוברים Drosophila בתנור 60 מעלות במשך 15 דקות. מניחים אותם בתמיסה של 100% של קסילן.

לאחר מכן אנו מתחילים בהתייבשות. מקם את השקופיות בכל אחד מפתרונות אלה למשך שלוש דקות כל אחת. ברגע שהמגלשה נמצאת במים מזוקקים, מניחים בתמיסת המטוקסילין למשך שתי דקות.

לאחר השלמת הקפד לנקז כמה שיותר של הפתרון ככל האפשר מן השקופית. לאחר השקופית נשטפה במים מזוקקים, ולאחר מכן להכתים את השקופית אאוזין במשך דקה אחת. לבסוף, להסיר את השקופית מן אאוזין לשטוף במים מזוקקים.

ברגע שהשקופית הזו תהיה נקייה, אנחנו מתחילים עכשיו את תהליך ההתייבשות הסופי שלנו. לבסוף להיות ממוקם לתוך 100% קסילן במשך חמש דקות. תהליך זה חוזר על עצמו בשני פתרונות חדשים של 100% קסילן ומפיל כמות קטנה של מסטיק נייטרלי לאורך קצה אחד של השקופית.

קח את החלקת הכיסוי הזו ומקם בעדינות בקצה אחד של השקופית. ראשית deparaffinize השקופיות על ידי הצבת 100% קסילן. ברגע שהמגלשות מוסרות ממים מזוקקים, הן צריכות להיות מכוסות בתמיסת חומצה תקופתית של 1%.

לאחר מכן אנו משליכים את התמיסה העודפת ושוטפים במים מזוקקים. על-ידי מיקום השקופית ישירות בפתרון שחומם מראש. ברגע שזה הושלם אנחנו שוטפים את השקופית במים מזוקקים ולאחר מכן לצבוע את הפתרון עם 0.2% כלוריד זהב במשך דקה עד שתי דקות.

לאחר מכן, אנחנו לתקן את הרקמה עם 3% נתרן thio סולפט במשך שלוש דקות באמצעות מים מזוקקים. ואז נגד ההמטוקסילין. לאחר ההטיה הנגדית, ניתן לשטוף את הכתם עם כל צינור של מים מזוקקים כפי שמוצג כאן.

ואז נעבור לתהליך ההתייבשות. בצע את זה על ידי הצבת השקופיות ישירות לתוך 100% xylene ולאחר מכן להחיל כמות קטנה של מסטיק ניטרלי על הפינה של השקופית. יש לכסות בעדינות בתעודת כיסוי.

התחל להכין את השקופיות כבעבר על-ידי ביטול פענוח וקסילן. ואז באחד על אחד קסילן אתנול. ברגע שהשקופיות מתפרקות, אנחנו מתחילים לייבש מחדש את הרקמה שלהן ואז סוף סוף ב-PBS.

מניחים את השקופיות ב 0.3% מי חמצן שנעשו מתנול במשך 10 דקות. לאחר מכן השקופיות מכוסות ב- 20 mLs של פתרון אחזור יעד. לאחר מכן ניתן למקם את השקופיות בתיבת הכתמים.

מניחים את קופסת הכתמים בתוך ספינת קיטור, ומוודאים ששום פתרון לא בורח והמגלשות עדיין מכוסות לחלוטין. שים לב כי מכסה תיבת הכתמים לא צריך להיות סגור לחלוטין, כך אדי מים יכולים לברוח במהלך תהליך האידוי. ואז שטיפה עדינה בPBS-T שלוש פעמים.

להשליך את הפתרון העודף ולחזור על התהליך, הפעם עם PBS. לאחר מכן, אנו מדגרים את השקופיות בבלוק מי חמצן במשך חמש עד 10 דקות ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים שוב ב- PBS-T ולאחר מכן ב- PBS. הכינו את הנוגדן ושחררו ישירות על הרקמה.

לאחר מכן ניתן לדגור על רקמות אלה או בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. הנוגדן המשני צריך להיות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות, אשר מכתים עם 5% DAB במשך שתיים עד 10 דקות. לאחר קבלת הצבע המתאים, לשטוף במים מזוקקים, ולאחר מכן counterstain בהמטוקסילין.

לאחר כתם המטוקסילין זה, השקופיות יכולות להיות מיובשות ברצף. מניחים את השקופיות לתוך 100% קסילן ולאפשר להשרות במשך שלוש דקות. לאחר מכן זרוק כמויות קטנות של מסטיק ניטרלי על קצה אחד של השקופית.

לאחר הנחת מסטיק, קחו את כיסוי השקופית והניחו בעדינות מקצה אחד של המגלשה. הוסף מיקרוגרם אחד של DNA תבנית ליניארית מטוהרת לבקבוקון תגובה סטרילי ללא RNase. לאחר מכן הוסיפו מספיק DEPC סטריליים ללא RNase שטופלו במים מזוקקים כפולים כדי ליצור נפח מדגם כולל של 13 מיקרוליטרים.

ואז צנטריפוגה לזמן קצר ודגרה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. עבור ניסויי הגנה RNase, אנו ממליצים דגירה במשך 15 דקות עם שני מיקרוליטרים של Dnase-1, ללא RNase כדי להסיר DNA תבנית. לאחר השלמת שלב הדגירה, עצרו את התגובה על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.2 טוחנת EDTA ב-pH של שמונה.

לפני השלבים להראות כאן השקופיות היו deparaffinized rehydrated, על פי הפרוטוקול שלנו הודגם בעבר. לאחר rehydration לדגור השקופיות 0.01 שומה לליטר PBS ב pBS ב pH של 7.4 במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר את הפתרון הקיבוע מן הרקמה. לאחר השטיפה ב- PBS, אנו שוטפים לאחר מכן עם תמיסת גליצין 100 מילימולרית לליטר במשך חמש דקות פעמיים כדי להסיר קבוצות אלדהיד בחינם מהרקמה.

לאחר שלב זה, לשטוף שקופיות עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, דגירה ב- PBS המכילה 0.3% טריטון X-100 במשך 15 דקות לפני השטיפה ולאחר מכן דגירה שוב עם מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר של חלבוןאז K.Next, תקן שקופיות עם 4% paraformaldehyde ו- PBS ב- pH של 7.2 למשך שלוש דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות לפני הדגירה עם 0.1 טוחן טריאתנולמין מאגר pH 8, המכיל 0.25% anhydride acetic.

באפשרותך לבחור להטות את התיבה בשלב זה כדי להבטיח כיסוי מלא עם הפתרון. התיבה מוכנה על ידי הוספת 20% גליצרול או DEPC מים לתחתית תיבת הכלאה יבשה. לאחר מכן, לכסות את השקופיות ב 20 מיקרוליטרים של פתרון טרום הכלאה.

דנ"א הזרע של הסלמון בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר לכל שקופית. ואז לדגור ב 42 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. זה נעשה בקופסה לחה מוכנה מראש כדי להבטיח כי הפתרון אינו מתייבש במהלך תהליך זה.

בשלב שלאחר ההיברידיה, חשוב מאוד שתמיסת ההיברידיזציה תשטוף לחלוטין מהדגימות שלכם. זה יכול להיעשות בשטיפה רצופה של 15 דקות ב 37 מעלות, באמצעות ארבע פעמים ריכוז SSC, פעמיים ריכוז כפול ריכוז אחד, 0.5 פעמים ריכוז ו 0.1 פעמים ריכוז SSC פתרון. כל דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שזה נעשה, לשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד לפני הוספת חיץ הכביסה. יש לשטוף את מאגר הכביסה במשך דקה אחת לפני השלבים הבאים ודאו שמאגר הכביסה יבש לחלוטין מהמגלשות לפני הוספת הפתרון הבא. הוסף 100 מיליליטר של פתרון חסימה לכל שקופית ודגר את השקופית במשך 30 דקות.

מומלץ לעשות זאת בסביבה נטולת אור כדי להבטיח כתמים טובים. הבא לדגור השקופיות במשך 30 דקות שוב ב 20 mLs של תמיסת נוגדנים. החל את פתרון הנוגדנים ישירות על שקופיות לכיסוי מלא של הרקמה שלך.

לאחר הדגירה הושלמה, להחיל 100 מיליליטר של חיץ כביסה. דגירה במשך 15 דקות בתנאים חופשיים קלים להסרת מצומדים נוגדנים לא מאוגדים. הסר את מאגר הכביסה.

לאחר מכן, להחיל 20 מיליליטר של מאגר זיהוי מותר לדגור במשך כארבע דקות. לאחר ארבע דקות, הסר את מאגר הזיהוי. יבש את השקופיות כדי להבטיח שאין פתרון נוסף והוסף 10 מיליליטר של פתרון מצע צבע טרי מוכן.

תגובה זו מתחילה תוך מספר דקות, אך היא הושלמה לאחר 16 שעות. אז אפשרו לדגור לתקופה זו של זמן במצב ללא אור. ברגע שהמקומות הרצויים שבהם מזוהות רצועות שוטפים את השקופית עם 50 מיליליטר של מאגר TE כדי לעצור את התגובה.

ואז להשלים את תהליך ההתייבשות שהוכח בעבר שלנו ואת תהליך ההרכבה עבור מסטיק נייטרלי. איורים 1 ו-2 מדגימים את שיטת ציפוי הג'לטין מאלומיניום כרום עבור מקטעי פרפין ואת שיטת ההטבעה לפרופיל הביטוי של FKBP12 ו- DmFKBP12 בפיתוח עוברים דרוזופילה. איור 3 מראה את התפלגות החלבון של נוגדנים שזוהו FKBP12 בשלבי הבלאסטרודרמה התאית הסינכיטית.

מן התוצאות היסטוכימיות האלה, ניתן לראות כי ביטוי FKBP12 הוא פחות מקוטב ב blastoderm הסינכיטיאלי, ואז מתחיל לוקליזציה בתוך קרום המרתף מתחת לאפיתל trophectoderm מודיע את ההדרגה עם ביטוי נוסף נמצא בקטבים הקדמיים והאחוריים. איור 4, העוקב אחר שלבי יחסי הגז המוקדמים והמאוחרים של העובר Drosophila מראה חלבון FKBP12 הופך מוגבל לרכיבים אדריכליים מסוימים של הרקמה העוברית הפרימיטיבית. עם התפלגות חוץ-תאית פחות מזו שנצפתה בשלבים עובריים גסטרו מוקדמים ומאוחרים.

מעניין לציין כי התפלגות החלבון הדינמית המתוארת לעיל אינה מלווה בשינויים מקבילים ברמות ה-MRI של FKBP12 כפי שניתן לראות באיור חמש. מה שמצביע על ביטוי חלבון כתוצאה ממנגנון מולקולרי פוסט-תמלולי שעדיין לא ידוע. קולטן Ryanodine מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד.

מוטציות בגן זה ידועות כגורמות להפרעות פיזיולוגיות רבות המובילות למחלות או למוות לבבי מוקדם. עם זאת, את התפקיד גן זה משחק בהתפתחות Drosophila מוקדם היה קשה ללמוד. כמרכיב מעבר של העובר, עובר עשיר בשומנים וכוריון עשיר בכיטין, להפוך את המחקרים של חלבון ביטוי עוברי בהתפתחות Drosophila מוקדם קשה.

ציפוי השקופיות, הטמעת העובר והטכניקות האימונוהיסטוכימיות המתוארות במאמר זה אפשרו לנו ללמוד בפירוט את ההתפלגות הדינמית של חלבון קולטן ריאנודין ו- mRNA. אנו חולקים טכניקות אלה ואת התקווה כי הם יאפשרו לאחרים ללמוד חלבונים אחרים בשלבי פיתוח מוקדמים של Drosophila.