Name: שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למדו שיטה כמותית למדידת פעילות אנזימטית של משפחת PRMT בתאים באמצעות ווסטרן בלוט פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל שימוש בביומרקרים ספציפיים וניתוח רמות מתילציה בארגינין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קונסורציום הגנומיקה המבנית הוא ארגון צדקה רשום (לא: 1097737) שמקבל כספים מ- AbbVie, באייר AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, גנום קנדה באמצעות מכון גנומיקה באונטריו [OGI-196], האיחוד האירופי ו- EFPIA באמצעות היוזמה לתרופות חדשניות 2 התחייבות משותפת [מענק EUbOPEN 875510], ינסן, מרק KGaA (aka EMD בקנדה ובארה"ב), פייזר, טקדה וקרן Wellcome [106169/ZZ14/Z

1. פולחן וציפוי תאים
הערה: תאי תרבות עם מדיה מומלצת ולבדוק באופן שגרתי לזיהום mycoplasma. תאי HEK293T , MCF7 ו- C2C12 נבחרו כדוגמאות מאחר שקווי תא אלה שימשו בהצלחה בהמחאות PRMT.
<ol><li>תרבות HEK293T, MCF7, ו C2C12 ב DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), פניצילין (100 U mL-1),ו סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם mL-1) ב 10 ס"מ רקמה תרבות מטופלים (TC) מנות.</li>
	<li>עבור הבדיקה PRMT8, לגדול PRMT1 בלתי ניתן להריסה HEK293T תאים במדיה המכילה דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 3 ימים לפני תחילת הבדיקה.</li>
	<li>כדי צלחת התאים, להסיר ולהשליך מדיה מהצלחת.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של PBS (ללא Ca+2 ו מ"ג+2 יונים) כדי לשטוף תאים ולהשליך את הפתרון.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%), דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן להשליך את הפתרון. דגירה עד שהתאים הופכים עגולים ומתנתקים מהצלחת. הקש על הצלחת כדי לסייע בניתוק תאים, במידת הצורך. לתאים שקשה לנסות, כגון C2C12, דגירה את הצלחת במשך 1-2 דקות ב 37 °C (69 °F). הערה: הימנע מחשיפה לתאים לפתרון טריפסין לפרקי זמן ארוכים יותר (>10 דקות) מכיוון שהוא יפחית את הכדאיות של התאים.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיה מראש לצלחת, ותאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי פירוק גושים התא. מעבירים תאים לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים 3-5 מ"ל של מדיה.</li>
	<li>כדי למדוד את מספר התא, לערבב 10 μL של תאים עם 10 μL של כחול Trypan ולהעביר 10 μL כדי hemocytometer או להשתמש בכל שיטת ספירת תאים אחרת.</li>
	<li>לדלל תאים לצפיפות התא המומלצת ולשים 500 μL / גם לתוך צלחות TC 24-גם(טבלה 1). עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), עבור לשלב 3.1.</li>
</ol>2. העברת תאים
<ol><li>עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfect HEK293T תאים עם הכמות המומלצת של DNA (טבלה 2). קל לבצע חילוף של תאי HEK293T כך שניתן יהיה להשתמש בכל מגיב של transfection, בהתאם להוראת היצרן.</li>
</ol>3. טיפול מורכב
הערה: אין לחרוג מריכוז דימתיל סולפוקסיד (DMSO) סופי של 0.1% במדיית התרבות. שמרו על אותו ריכוז DMSO בכל באר. מעכבי PRMT סלקטיביים (בדיקות כימיות) ואנלוגיות לא פעילות הקשורות קשר הדוק שלהם ניתן למצוא בטבלה 3.
<ol><li>עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), הסר מדיה מתאים והחלף ב- 500 μL של מדיה ב- DMSO או ב- DMSO בלבד (בקרה). הערה: זה בדרך כלל לוקח 2 ימים כדי לבחון מעל 80% ירידה ברמות מתילציה R.</li>
	<li>עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8), הסר מדיה 4 שעות לאחר transfection, להוסיף 500 μL של מדיה עם מורכב או DMSO לבד (שליטה), ואת הדגירה עבור 20-24 שעות.</li>
</ol>4. הכנת lysate התא
<ol><li>הסר את כל המדיה מבארות, לשטוף עם 100 μL של PBS כדי להסיר מדיה שיורית, ולהוסיף 60 μL של מאגר תמוגה (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 10 mM MgCl2, 0.5% טריטון X-100, 12.5 U mL-1 בנזונז, להשלים קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA) לכל באר.<ol>
<li>דגירה במשך פחות מ 1 דקות ב RT, נדנדה את הצלחת כדי להפיץ את מאגר תמוגה על התאים. לאחר מכן להוסיף 3 μL של 20% w / v נתרן דודכיל סולפט (SDS), כדי סופי 1 % ריכוז, ומערבבים על ידי רועד בעדינות. מעבירים את lysate לצינורות מיקרוצנטריפוגה ושומרים אותו על הקרח. הערה: יש להוסיף קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. התוספת של בנזונאס במהירות הידרוליזה חומצות גרעין אשר מפחית צמיגות ליזלת התא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימות באמצעות ערכת Assay חלבון BCA או להשתמש בכל שיטה אחרת אשר סובל 1% SDS בתמיסה.<ol>
<li>הוסף 2 μL של ליזלת ותקני חלבון (0, 1, 2, 4, ו 8 מיקרוגרם / מ"ל של BSA במאגר תמוגה) לתוך בארות של צלחת 96-היטב ברור.</li>
		<li>מערבבים ריאגנט A עם ריאגנט B ביחס של 50:1 ומוסיפים 200 μL לבאר. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולקרוא את הספיגה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתאים את ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה כדי להיות שווה על פני הדגימות.</li>
	<li>הוסף 20 μL של מאגר טעינה 4x ל 60 μL של ליזלת תאים וחום ב 95 °C (65 °F) במשך 5 דקות. לאחר פירוק חום, lysates ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. ניתוח כתמים מערבי
<ol><li>טען 5-20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לניתוח חלבוני היסטון ו-20-100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים לתוך ג'ל חלבון ביס-טריס 4-12%.</li>
	<li>הפעל את הג'ל במאגר ריצה MOPS SDS (50 MM MOPS, בסיס טריס 50 מ"מ, 0.1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7.7) במשך כ 2 שעות ב 100 V או עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.</li>
	<li>אם אתם מבצעים העברה רטובה, הרכיבו את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח (25 mM Tris, 192 מ"מ גליצין, 20% v/v מתנול ו-0.05% w/v SDS).<ol>
<li>מניחים ספוגים, נייר סינון, קרום PVDF וג'ל בהתאם להוראות היצרן. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה. הערה: השתמש בקרום סופג PVDF המערבי המומלץ שכן יש לו שפעת אוטומטית נמוכה והתאמה לחלבונים במשקל מולקולרי נמוך, כגון היסטונים (שולחן החומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1.5 שעות על הקרח.</li>
	<li>חסום קרום למשך 30 דקות בחסימת חיץ (5% חלב עם אגירה פוספטית, PBS). יש לשטוף עם חיץ כביסה (PBST: 0.1% v/v Tween-20 ב-PBS), ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת אלבומין סרום שור (BSA) (5% BSA ב-PBST) לילה ב-4°C(טבלה 3). הערה: לאחסון ארוך יותר, יש לחטא את פתרון BSA במסנן, להוסיף 0.02% עם נתרן אזיד ולשמור על 4 °C (60 °F).</li>
	<li>לשטוף קרום 3 x 5 דקות עם PBST. ואז דגירה עם עז נגד ארנב (IR800) וחמור נגד עכבר (IR680) נוגדנים במאגר חסימה מומלץ(שולחן החומרים, טבלה 3)במשך 30 דקות ב RT ולשטוף 3 x 5 דקות עם PBST.</li>
	<li>קרא את האות על תמונה כתם מערבי פלואורסצנטי ב 800 ו 700 ננומטר. רצוי להשתמש בכלי המאפשר הדמיה רצועות חזקות ועמימות בבירור בתמונה אחת עם רגישות גבוהה וטווח דינמי, יחס אות לרעש גבוה, אזהרה כאשר מגיעים לרוויה בתמונה, כמו גם ריבוי של שני צבעים פלואורסצנטיים באותה רצועה לדוגמה.</li>
	<li>קבע את עוצמות הרצועה עבור ניתוח כתמים מערביים באמצעות תוכנה מתאימה להדמיה מערבית פלואורסצנטית.</li>
</ol>

<ol><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+Methylation%3A+The+Coming+of+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine Methylation: The Coming of Age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Bedford, M. T., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+an+emerging+regulator+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation an emerging regulator of protein function.</a> Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+RGG%2FRG+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Defining the RGG/RG motif.</a> Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).</li>
<li>Dhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+major+Type+I+arginine+methyltransferase+PRMT1+causes+substrate+scavenging+by+other+PRMTs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs.</a> Science Reports. 3, 1311(2013).</li>
<li>Kaniskan, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent%2C+selective+and+cell-active+allosteric+inhibitor+of+protein+arginine+methyltransferase+3+%28PRMT3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3).</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).</li>
<li>Eram, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent%2C+Selective%2C+and+Cell-Active+Inhibitor+of+Human+Type+I+Protein+Arginine+Methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Cell-Active+Dual+Inhibitor+of+Protein+Arginine+Methyltransferase+4+and+Protein+Arginine+Methyltransferase+6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).</li>
<li>Nakayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP-064%2C+a+potent+and+selective+small+molecule+inhibitor+of+PRMT4+for+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma.</a> Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).</li>
<li>Bonday, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LLY-283%2C+a+Potent+and+Selective+Inhibitor+of+Arginine+Methyltransferase+5%2C+PRMT5%2C+with+Antitumor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).</li>
<li>Szewczyk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+PRMT7+links+arginine+monomethylation+to+the+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response.</a> Nature Communications. 11 (1), 2396(2020).</li>
<li>Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+yields+protein+arginine+methyltransferase+1+isoforms+with+distinct+activity%2C+substrate+specificity%2C+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).</li>
<li>Siarheyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allosteric+inhibitor+of+protein+arginine+methyltransferase+3%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3.</a> Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).</li>
<li>Stefansson, O. A., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARM1+and+BAF155%3A+an+example+of+how+chromatin+remodeling+factors+can+be+relocalized+and+contribute+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer.</a> Breast Cancer Research. 16 (3), 307(2014).</li>
<li>Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pICLn+in+methylation+of+Sm+proteins+by+PRMT5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).</li>
<li>Guccione, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3R2+by+PRMT6+and+H3K4+by+an+mLL+complex+are+mutually+exclusive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive.</a> Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).</li>
<li>Yudao Shen,, L, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+First-in-class%2C+Highly+Selective+and+Cell-active+Allosteric+Inhibitor+of+Protein+Arginine+Methyltransferase+6+%28PRMT6%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6).</a> BioRxiv. , 1-21 (2020).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+interacting+with+protein+arginine+methyltransferase+8%3A+the+Ewing+sarcoma+%28EWS%29+protein+binds+independent+of+its+methylation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state.</a> Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).</li>
<li>Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT8%2C+a+new+membrane-bound+tissue-specific+member+of+the+protein+arginine+methyltransferase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).</li>
<li>Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS+is+a+substrate+of+type+I+protein+arginine+methyltransferase%2C+PRMT8%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8.</a> International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT9+is+a+type+II+methyltransferase+that+methylates+the+splicing+factor+SAP145%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145.</a> Nature Communications. 6, 6428(2015).</li>
<li>Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+epigenome+functions+of+PRMTs+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates.</a> Methods. 1175, 53-65 (2020).</li>
<li>Musiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+profiling+of+arginine+methylation+defines+PRMT5+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity.</a> Science Signaling. 12 (575), (2019).</li>
<li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+Computational+Approaches+for+the+Large-Scale+Analysis+of+Protein+Arginine+Methylation+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li>
<li>Shishkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+CARM1+substrates+defines+enzyme+specificity+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition.</a> Nature Communications. 8, 15571(2017).</li>
<li>Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+I%3A+substrate+specificity+and+role+in+hnRNP+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או אינטרסים סותרים אחרים להצהיר עליהם.

כאן מתוארים פרוטוקולי הבדיקה הסלולרית המפורטים לבני משפחת PRMT המשתמשים בשיטות סופגות מערביות פלואורסצנטיות. מצעים ייחודיים שעבורם ניתן לזהות בקלות את השינויים במתילציה של ארגינין על אובדן PRMT בודד או עיכוב קטליטי ולא ניתן לפצות אותם על ידי בני משפחה אחרים נבחרו. חלבונים מסוימים מתילציה על ידי PRMTs מרובים21,23, מציע חפיפה ספציפית מצע שבו כמה PRMTs לתרום רק כמות קטנה של סימן הסלולר במצע חלבון נתון24,25,26,27, למשל, הן PRMT8 ו PRMT1 לתרום מתילציה של EWS. לכן, כל בדיקה דרשה אימות יסודי של מצעים ונוגדנים עם ניסויי הפלה ו/או דיכוי יתר ואימות נוסף עם מעכבים סלקטיביים מאופיינים היטב. PRMT מצעים ספציפיים זוהו אשר שינויים סימן מתילציה ניתן לזהות בתוך 2-3 ימים לאחר PRMT הפסד / עיכוב, כדי למנוע השפעות הרכבה של הכדאיות התא מופחת התפשטות שעלולה להשפיע בעקיפין על רמות סימן מתיל ארגינין. למרות שניתן היה למצוא מצעים ייחודיים עבור PRMT1, 4, 5, 7 ו- 9; עבור PRMT3, 6, ו 8 הרווח של גישת פונקציה היה צריך להיות מועסק. מספר נוגדנים ספציפיים למתיל ארגינין נבדקו למטרות תאיות שונות, אך אף אחד מהם לא הצליח לזהות שינויים משמעותיים בתוך 3 ימים מהפלת PRMT3 ו- PRMT6; לכן, מבחני סמנים ביולוגיים פותחו באמצעות אנזימים מבוטאים חוץ רחמית יחד עם מוטנטים לא פעילים קטליטית, אשר שימשו כפקד על מתילציה מצע הבסיס. PRMT8 הוא הומולוג PRMT1 קרוב וחולק העדפות מצע דומות. כמו סמן ביולוגי סלקטיבי PRMT8 לא ניתן היה לזהות, הבדיקה בתאי ההפלה PRMT1 פותחה, שם PRMT8 הובע במשותף יחד עם EWS. PRMT1 הוא גם אנזים מרכזי האחראי על מתילציה אסימטרית H4R3, ולכן, להשתמש H4R3me2a כמו סמן ביולוגי עבור PRMT3 ו PRMT6 מבחנים הסלולר, תאים עם רמות נמוכות הבסיסית H4R3me2a נבחרו, כמו גם מוטציות לא פעילים קטליטי שימשו כבקרת רקע. למרות מבחנים אנדוגניים עדיפים, מבחנים אקסוגניים להוכיח לא יסולא בפז לבדיקת העוצמה התאית של מספר מעכבי PRMT סלקטיבי7,8,9. עם הידע הגובר של ביולוגיה PRMT, אנו מצפים לשפר את מבחני על ידי מציאת חלבונים סמנים ביולוגיים ספציפיים יותר עבור PRMT3, PRMT6, ו PRMT8.
השימוש בנוגדנים מאומתים ובקרות מתאימות הם קריטיים לביצועי מבחני PRMT. כל הנוגדנים המומלצים כאן קיבלו תוקף יסודי על ידי ניסויי הפלה ודיכוי יתר, עם זאת, הבדלי אצווה לאצווה, במיוחד במקרה של נוגדנים פוליקלונליים, עדיין עשויים להשפיע על הביצועים שלהם. לכן, חיוני להשתמש בשיטות גנטיות ובדיקות כימיות יחד עם הבקרות השליליות הקשורות קשר הדוק שלהם כדי לאשר את אמינות הבדיקה. בנוסף, עבור מבחני PRMT הדורשים ביטוי יתר של חלבון, חיוני להשתמש במוטנטים לא פעילים קטליטית יחד עם חלבון מסוג בר כדי לקבוע את רמות המתילציה הבסיסית.
אוסף זה של מבחנים כמותיים ליצירת פרופיל הפעילות של PRMTs בתאים יכול להיות שימושי באופן נרחב עבור הקהילה המדעית שכן ניתן ליישם אותו במהירות ובקלות עם ציוד מינימלי ומומחיות טכנית מוגבלת, הכוללת רק טכניקות בסיסיות של culturing תאים ו fluorescent המערבי סופג. הנוגדנים המומלצים ובדיקות כימיות עבור PRMTs יכולים לשמש גם עבור בדיקות פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) כדי לקבוע את ההתאמה של בדיקה ABPP נתון, לפקח על מעורבות היעד, ולהעריך את ההשפעות מחוץ ליעד באמצעות פורמט ABPP תחרותי. גישות פיתוח מבחני הדיון כאן יכולות גם להיות מעודנות עבור משפחות אנזימים אחרות כגון ליצין חלבון-מתילטרנספראזים ואצטילטרנספראזים.

מתילציה ארגינין הוא שינוי פוסט-תרגום חשוב המסדיר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-RNA, ובכך ממלא תפקיד חשוב בתהליכים תאיים שונים כגון שחבור טרום-mRNA, נזק ל- DNA, תגובת שעתוק ותת-תזוזה בתיווך גורמיגדילה 1,2. ארגינין הוא מתילציה על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) וכתוצאה מכך מונומתיל ארגינין (Rme1), דימתילרגינין אסימטרי (Rme2a), או דימתילרגינין סימטרי (Rme2s)3. בהתבסס על סוג המתילציה, PRMTs מסווגים לשלוש קבוצות: סוג I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו- 8), אשר מזרז דימתילציה מונו ואסימטרית; סוג II (PRMT5 ו- PRMT9), אשר מזרז דימתילציה מונו וסימטרית; וסוג III (PRMT7), אשר יכול רק מונומתילאט ארגינין3.
בשל מספר גדל והולך של נוגדנים ספציפיים מתילציה ארגינין זמין מסחרית, פעילות PRMT ניתן למדוד באמצעות סופג המערבי. כתם מערבי מבוסס פלואורסצנטי הוא הטכניקה המועדפת על פני זיהוי chemiluminescent בשל טווח דינמי גדול יותר ליניאריות, רגישות גבוהה יותר, ומאפשרמולטיפלקסים 4. כדי לכמת את רמות המתילציה של החלבון, נדרשת נורמליזציה של אות המתילציה לרמות החלבון הכוללות. על ידי בחירת הנוגדנים לחלבון כולל ומתילציה שגדל במינים מארחים שונים (למשל, עכבר וארנב), ניתן להשתמש בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופורים שונים ואת האות לשני הנוגדנים ניתן לקבוע באותה רצועת מדגם. נוגדנים מתיל ארגינין פותחו כדי לזהות ולאפיין monomethylated, א-סימטרי, או חלבונים דימתילציה סימטרית שבו מתיל ארגינין נמצא בהקשר מסוים. מאז רוב PRMTs מתילאט גליצין- ומוטיבים עשירים ארגינין בתוך המצעים שלהם5, מספר נוגדנים הועלו עבור פפטידים המכילים monomethyl או אסימטרי, סימטרי דימתיל ארגינין-גליצין חוזר כגון D5A12, ASYM24, או ASYM25, ו SYM11, בהתאמה. נוגדנים אחרים מתיל ארגינין נוצרו נגד ספריית פפטיד המכילה דימתיל אסימטרי, סימטרי ומונומתיל ארגינין בהקשר חוזר המאפשר זיהוי של מתיל ארגינין בהקשרים מסוימים אלה6. יש גם מספר גדל והולך של נוגדנים המזהים סימן ארגינין ספציפי על חלבון יחיד המאפשר זיהוי סלקטיבי של מתילציה כגון histone H4R3me2a או BAF155-R1064me2a.
ישנם מספר מעכבי PRMT זמינים מסחרית, אשר יכול לשמש ככלים עבור מבחנים סלולריים PRMT. עם זאת, לא כולם מאופיינים ביסודיות סלקטיביות ואפקטים מחוץ ליעד וחלקם יש להשתמש בזהירות. הקונסורציום הגנומי המבני, בשיתוף עם מעבדות אקדמיות ושותפי פארמה, פיתח מעכבי PRMT חזקים, סלקטיביים וחוטמים לתאים (בדיקות כימיות) הניתנים לשימוש ללא הגבלות על ידי הקהילה המדעית. מידע על מעכבים אלה ניתן למצוא על https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. בדיקות כימיות הן מעכבי מולקולה קטנה עם במבחנה IC50 או Kd < 100 nM, סלקטיביות פי 30 על חלבונים באותה משפחה, ופעילות תאית משמעותית ב 1 מיקרומטר. בנוסף, לכל בדיקה כימית יש אנלוגי כימי קרוב שאינו פעיל נגד היעד המיועד7,8,9,10,11,12.
מטרת פרוטוקול זה היא למדוד את הפעילות הסלולרית של בני משפחת PRMT בודדים בשיטת הכתם המערבי הפלואורסצנטי. כאן מסופקים מידע מפורט על סמנים ביולוגיים מאומתים, נוגדנים ומעכבים חזקים הפעילים בתאים, כמו גם אסטרטגיות יקרות ערך ליישום מוצלח של מבחני אחריות.

<table><tbody><tr><td>10 ס"מ צלחות TC</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>צלחות TC 24 בארות</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 12% ג'ל חלבון Bis-Tris</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond P PVDF ממברנה</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>anti-Asym 24</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-414</td><td></td></tr><tr><td>anti-Asym 25</td><td>Millipore-Sigma</td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-BAF155</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיות</td><td>sc-32763</td><td></td></tr><tr><td>anti-BAF155-R1064me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>ABE1339</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG (#, 1:5000)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab10799</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3R2me2a</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-848</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3R8me2a</td><td>רוקלנד</td><td>600-401-I67</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-H4</td><td>Abcam</td><td>ab174628</td><td></td></tr><tr><td>anti-H4R3me2a</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39705</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hsp/Hsc70</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-820</td><td></td></tr><tr><td>anti-PRMT1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-404</td><td></td></tr><tr><td>anti-PRMT3</td><td>Abcam</td><td>ab191562</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PRMT4</td><td>Bethyl</td><td>#A300-421A</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PRMT5</td><td>Abcam</td><td>ab109451</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PRMT6</td><td>Abcam</td><td>ab47244</td><td></td></tr><tr><td>anti-PRMT7</td><td>Abcam</td><td>ab179822</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme1</td><td>CST</td><td>8015</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2a</td><td>CST</td><td>13522</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2s</td><td>CST</td><td>13222</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)</td><td></td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)</td><td>Abcam</td><td>ab56800</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145-R508me2s</td><td></td><td></td><td>מתנה נדיבה מד"ר יאנז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה</td></tr><tr><td>נגד SMBB'</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיות</td><td>SC-130670</td><td></td></tr><tr><td>בנזונאז</td><td></td><td></td><td>מיוצר בבית</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td></td><td></td><td>מתנה מד"ר סטפן ריצ'רד, אוניברסיטת מקגיל</td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ביושופ</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG-IR680</td><td>Licor</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביושופ</td><td>GLN002.5</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי-ארנב IgG-IR800</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>מתנת HEK293T</td><td></td><td></td><td>מד"ר סם בנצ'ימול,</td></tr><tr><td>תוכנת סטודיו התמונות של אוניברסיטת יורק גרסה 5.2</td><td>מאגר טעינת Licor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: מאגר מדגם NuPAGE LDS (4x)</td> <td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td></td><td>ATCC&reg; HTB-22 וסחר;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חסימת אודיסיאה (לדלל 4 x עם PBST)</td> ניתן להשתמש גם במאגר חסימת <td>Licor</td><td>927-40000</td><td>(PBS) # 927-70001</td></tr><tr><td>Odyssey CLX Imaging System</td><td>מספר</td><td>דגם 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS (תרבית רקמות)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS (כתם מערבי)</td><td>Bioshop</td><td>PBS405.4</td><td></td></tr><tr><td>penstrep</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td></td></tr><tr><td>TC20 מונה תאים אוטומטי</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (0.25%)</td><td>Wisent</td><td>325-043-EL</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>ביושופ</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ביושופ</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

מתילטרנספראז חלבונים (PRMTs) מזרזים את העברת קבוצת מתיל לשאריות ארגינין של חלבוני מצע. משפחת PRMT מורכבת מתשעה חברים שיכולים לעשות מונומטילט או שאריות ארגינין סימטריות/א-סימטריות. מספר נוגדנים המזהים סוגים שונים של מתילציה ארגינין של חלבונים שונים זמינים; לפיכך, מתן כלים לפיתוח מבחני סמנים ביולוגיים של פעילות PRMT. מבחנים מבוססי נוגדנים PRMT מאתגרים בשל מצעים חופפים וספציפי נוגדנים מבוססי מוטיב. נושאים אלה ואת ההתקנה הניסיונית לחקור את מתילציה ארגינין שנתרם על ידי PRMTs בודדים נדונים. באמצעות הבחירה הקפדנית של המצעים הייצוגיים שהם סמנים ביולוגיים לשמונה מתוך תשעה PRMTs, תוכנן פאנל של מבחני פעילות PRMT. כאן, הפרוטוקולים עבור מבחנים תאיים כמותי מדידת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים של משפחת PRMT בתאים מדווחים. היתרון של השיטות המתוארות הוא הביצועים הפשוטים שלהם בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות. הספציפיות של המצע ואמינות הנוגדנים שנבחרו אומתו במלואן עם גישות של הפלה ודיכוי יתר. בנוסף להנחיות מפורטות של סמנים ביולוגיים ונוגדנים לבדיקה, מסופק גם מידע על השימוש באוסף תרכובות של כלי מעכבים עבור PRMTs.

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

Protein methyltransferases (PRMTs) catalyze the transfer of a methyl group to arginine residues of substrate proteins. The PRMT family consists of nine ...

מטרת הליך זה היא למדוד את הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז בתאים. הפעילות נמדדת על ידי קביעת רמות מתילציה ארגינין שלהם ואת הרמות הכוללות של חלבון ביו סמן באמצעות סופג פלואורסצנטי כמותי המערבי. היתרון של השיטה המתוארת הוא הביצועים הפשוטים בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות.ההנחיות המפורטות לגבי סמנים ביולוגיים, נוגדנים ומעכבים שתי תרכובות מסופקים במאמר. וכאן תיארנו צעדים מכריעים המעורבים בהליך הניסויי. ואת ההליך מוצג עבור 24 פורמט היטב.ראשית, הכינו מאגר תמוגה, הוסיפו קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. הסר את כל המדיה מבארות. לשטוף עם 100 מיקרוליטר PBS, ולהוסיף 60 microliters של מאגר תמוגה לבאר.דגירה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, נדנדה את הצלחות כדי להפיץ את מאגר התמוגה על התאים. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 20%SDS כדי למצוא ריכוז של 1% ולערבב על ידי טלטול עדין. מעבירים את הליזאט לצינורות אפנדורף ושומרים אותו על הקרח.קבעו את ריכוז החלבון של הדגימות שלכם באמצעות ערכת בדיקה של חלבון BCA, או השתמשו בכל שיטה אחרת שסובלת מ-1%SDS בתמיסה. לאחר התאמת ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה להיות שווה על פני הדגימות ב 20 microliters של ארבע פעמים טעינת מאגר 60 microliters של ליזאט התא, וחום ב 95 מעלות במשך חמש דקות. התוספת של בנזונאס למאגר תמוגה במהירות הידרוליזה חומצות גרעין, אשר להפחית צמיגות ליזלת התא.ליסטים עם בנזונז אינם צמיגים. Lysates ללא בנזונס יש גוש גדול של DNA דביק כי לא גלולה כאשר סובב. טען ל-5 עד 20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לחלבוני היסטון, ו-20 עד 100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים בג'ל חלבון שיפוע של 4 עד 12 ביס-טריס.סביב הג'לי בסחבות כחוצץ שמסביב במשך כשעתיים ב 100 וולט, או עד צבע העמסה הכחול מגיע לתחתית הג'ל. אם אתה מבצע העברה רטובה, להרכיב את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה.מניחים נייר מסנן ספוגים, קרום PVDF וג'ל על פי הוראות היצרן. מעבירים חלבונים במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1 עד 1.5 שעות על קרח. לאחר ההעברה, דגירה הממברנה במשך 30 דקות בחסימה חוצץ.יש לשטוף עם חיץ שטיפה, ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים במשך הלילה בארבע מעלות. למחרת, לשטוף קרום שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף, דגירה עם נוגדנים משניים שכותרתו פלואורסצנטית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף. מניחים את הממברנה עם הפנים כלפי מטה על צלחת הזכוכית של הדימוי הכתם המערבי הפלואורסצנטי.מכסים עם יריעת הגומי ומסירים את כל בועות האוויר. קרא את האות ב-700 ו-800 ננומטר. לאחר סיום הסריקה, עבור אל התמונה והתאם אות ערוץ 700 ו- 800 כדי לראות רצועות בבירור.כאן אות ערוץ 700 המוצג כאדום מייצג את רמות החלבון הכוללות, ואות ערוץ 800 המוצג כירוק מייצג את רמות החלבון המתילציה. לאחר מכן, עבור אל ניתוח ובחר קריאה חציונית עליונה ותחתונה. למדידת עוצמת הרצועות, בחרו בכלי מלבן ציור וציירו את הצורה סביב הרצועות שברצונכם לכמת.עבור לצורות שבהן אתה מוצא עוצמות של 700 ו- 800 ערוצים. העמודה הנקראת אות מספקת רמות אינטנסיביות עם רקע מופחת. ניתן להעתיק את התוצאות ישירות לקובץ Excel.הנה הדוגמה המציגה את הניתוח של פעילות PRMT1 בתאים על עיכוב עם מעכב מסוג PRMT אחד MS023. פעילות PRMT1 נמדדת על ידי קביעת רמות דימתילציה אסימטרית H4 היסטון H4. כאן, רמות המתילציה, הרצועות הירוקות יורדות באופן תלוי מינון, בעוד שרמות ההיסטון הכוללות של הרצועות האדומות נשארות ללא שינוי.כדי לקבוע תרכובת IC50, להתוות את הלוגריתם של ריכוז מעכבים נגד histone H4 ארגנין-3 רמות דימתילציה אסימטרי מנורמל לרמות histone הכולל ואחריו ניתוח התאמה לא ליניארית. השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי כפול אחראי וניתן לשחזור של פעילות החלבון מתיל טרנספראז בתאים. היתרון של השיטה הוא שהיא משתמשת במתודולוגיית סופג מערבית ידועה הנגישה למעבדות אקדמיות וניתן לשנותה בקלות בהתאם לציוד המעבדה.פרטי ההסתעפות כולל חלבוני סמן ביולוגי, נוגדנים ושתי תרכובות כימיות עבור כל בן משפחה PRMT בודדים מסופקים במאמר.

quantitative-methods-to-study-protein-arginine-methyltransferase-1-9

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

למדו שיטה כמותית למדידת פעילות אנזימטית של משפחת PRMT בתאים באמצעות ווסטרן בלוט פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל שימוש בביומרקרים ספציפיים וניתוח רמות מתילציה בארגינין.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

גלה סרטונים נוספים