יצירת פרופיל של שינוי H3K4me3 בצמחים באמצעות מחשוף תחת מטרות ותגיות
April 22nd, 2022
מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.
המטרה הכללית של הניסוי הייתה לזהות שברי דנ"א הקשורים לחלבון ברחבי הגנום, ששיקפו את מצב הכרומטין. כדי להשיג מטרה זו, בוצעו שלושה מבצעים מיוחדים. קודם כל, הגרעינים השלמים מתאי הצמח היו מבודדים.
שנית, שינויים בכרומטין זוהו על ידי נוגדן מסוים במקום. שלישית, הנוגדן הקושר חלבון A-transposase היתוך חלבון, Tn5 transposase, לבקע את הכרומטין במקום תחת ההפעלה של יוני מגנזיום. שברי הדנ"א ואתרי איגוד שינוי הכרומטין שולבו אז עם מתאמים והוכנו להכנת DNA.
העשרת תגובת שרשרת פולימראז שיפור רצף הדור. רגולציה אפיגנומיקה ברמה הכרומטית, כולל שינויי DNA והיסטון, התנהגויות של גורמי שעתוק, ו- RNAs שאינם מקודדים עם החלבונים המגויסים שלהם, מובילים לשליטה זמנית ומרחבית בביטוי הגנים. טכנולוגיית CUT&Tag שפותחה על ידי מעבדת Henikoff היא שיטת קשירת אנזימים ליצירת פרופיל אפיגנומיקה של כרומטין ביעילות גבוהה.
כאן אנו מעסיקים את עלי הכותנה כחומרים ניסיוניים, וכדי לבצע את פרופיל הכרומטין באמצעות נוגדן של Histone H3 ליזין-4 טרימתילציה כדוגמה. אנו מספקים פרוטוקול מעודן עם וידאו לביצועי CUT&Tag בצמחים. עבור כל הכנת מדגם באמצעות CUT&Tag, נאסף גרם של רקמת עלה כותנה.
העלה נטחן לאבקה עדינה עם חנקן נוזלי, והועבר לצינור בז 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן A.פתרון החיץ היה מעורבב בעדינות, ואת הצינור היה דגירה על קרח במשך חמש דקות עם רועד עדין כדי לפזר את החומר באופן שווה. לאחר מכן הוא סובב ב 500 כוח צנטריפוגלי יחסית או rcf, ב 4 מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות, כדי ליצור את גלולה התא. הסופר-ננטנט ננטש והכדור הוחזר עם 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן B, בתוספת 0.5% טריטון.
הצינור היה הפוך בעדינות כדי resuspend הכדור לחלוטין. lysate התא שנוצר לאחר מכן היה מסונן עם שילוב של שני מסננים, מסננת 500-רשת שימשה על גבי כדי להסיר את פסולת הרקמה הגדולה יותר. ומסננת של 1000 רשת שימשה בתחתית כדי לאסוף את הגרעינים.
הבחירה בגודל הרשת המתאים של המסננות תלויה בגודל הגרעינים של הצמחים. נייר סינון סטרילי שימש בצד האחורי של המסננת כדי לספוג חלק של lysate ופסולת תאים קטנים. הליסט המכיל את הגרעינים הועבר לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר, וסובב ב-300 RCF במשך ארבע דקות, ב-4 מעלות צלזיוס מעלות צלזיוס כדי לאסוף את הגרעינים.
לאחר צנטריפוגה, קצה פיפטה שימש כדי להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר. כמות של 800 מיקרוליטרים, חיץ כביסה גרעינית נוספה. והצינור התהפך בעדינות כדי לשקם את הגרעינים.
הצינור היה סובב שוב ב 300 RCF, במשך ארבע דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שטיפות בסך הכל, הגרעינים שהתקבלו שולבו בצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר, והסתובבו ב 300 rcf, במשך ארבע דקות ב 4 מעלות צלזיוס. קצה פיפטה שימש להסרת המאגר הנותר ככל האפשר.
השלב הבא היה הדגירה של הנוגדן. aliquot של 50 microliters של גרעינים היה resuspended ב 1 מיליליטר של חיץ נוגדנים בתוספת EDTA, BSA, קוקטייל מעכב פרוטאז דיגיטונין. aliquot של 150 מיקרוליטר של השעיית הגרעינים הונח בצינור טרי 1.5 מיליליטר לתגובה אחת, שני מיקרוליטרים של נוגדנים נוספו לכל צינור.
בבדיקה זו, שני שכפולים ביולוגיים עבור נוגדן אנטי-היסטון-H3-ליזין-4-טרימתילציה ו immunoglobulin G קבוצות בקרה שליליות הוקמו לאחר נוגדנים נוספו. הפתרון היה מעורבב בעדינות, ואת הצינורות נותרו על שייקר אופקי עבור הכלאה לילה בארבע מעלות צלזיוס ב 12 סל"ד. למחרת בבוקר, הצינורות הוצאו והגרעין נשטף באמצעות 800 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת משקעים חיסוניים.
הצינור היה הפוך בעדינות לערבוב והוא נשאר על שייקר אופקי במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ב 12 סל"ד. לאחר הכביסה, הצינור היה סובב ב 300 rcf במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, supernatant הוסר באמצעות קצה פיפטה.
זה חזר על עצמו במשך שלוש כביסות בסך הכל. לאחר השטיפה השלישית, הצינור היה סובב 300 rcf במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, וקצה פיפטה שימש כדי להסיר את המאגר הנותר ככל האפשר. כדי להכין את תערובת Tn5 transposase לדגירה.
מיקרוליטר אחד של טרנספוזאז נוסף לכל 150 מיקרוליטרים של מאגר הדגירה של טרנספוזאז. אנו ממליצים להכין את תמהיל פתרון transposase הראשון על פי מספר התגובות. ואז להוסיף aliquot של 150 מיקרוליטרים לכל צינור.
התמיסה התערבבה בעדינות והושארה על שייקר אופקי בטמפרטורת החדר ב-12 סל"ד למשך שעתיים. הצינורות היו מעורבבים בעדינות כל 10 עד 15 דקות. לאחר הדגירה, הגרעינים נשטפו שלוש פעמים באמצעות 800 מיקרוליטרים של חיץ שטיפת משקעים אימונו בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החילוף Tn5 מאוגד.
לאחר השטיפה השלישית, הצינור היה סובב ב 300 rcf במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס, וקצה פיפטה שימש להסרת החיץ הנותר. עבור שלב התיוג, 300 מיקרוליטרים של מאגר תיוג נוספו לצינור התגובה. הפתרון היה מעורבב היטב ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה נוספו 10 מיקרוליטרים של 0.5 מול לליטר EDTA ב-30 מיקרוליטרים של 10% SDS כדי לקבוע את התגובה. 300 המיקרוליטרים הבאים של מאגר חילוץ דנ"א נוספו. בוצע חילוץ דנ"א לא סדיר.
שברי הדנ"א הומסו ב-25 מיקרוליטרים של מים סטריליים. 24 מיקרוליטרים שימשו להגברת PCR בבניית ספריית NGS. נתון זה מציג את כתם הגרעינים השלם עם DAPI בתמונה, תחת מיקרוסקופ המשיג כמות מספקת של גרעינים שלמים ונקיים יחסית הוא הצעד הקריטי עבור CUT&Tag.
לאחר PCR, שני מיקרוליטרים הועברו וגודל ה- DNA נבדק על 1.5% ג'ל אגרווז. נתון זה מראה כי להשוות עם שליטה שלילית בגן אימונוגלובולין. עיקר שברי הדנ"א מדגם הייסטון H3 ליזין 4 טרימתילציה צריך לנוע בין 280 ל 500 זוגות בסיס.
ניתן לטהר את שברי הדנ"א ולאחר מכן לפרופיל על ידי רצף תפוקה גבוהה. נתון זה מציג את רצף יצירת התוצאות עבור נוגדן האנטי-היסטון H3 ליזין 4 טרימתילציה בהשוואה לקבוצות בקרה שליליות אימונוגלובולין G. טכנולוגיה זו מייצרת את ספריות ה- DNA ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט בהשוואה ל- ChIP-seq.
CUT&Tag היא שיטה חדשה ועדיין מתבצעת.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את היישום המעודן של שיטת CUT&Tag לפרופיל אפיגנומי בצמחים, תוך התמקדות בשינויים בהיסטונים. המטרה העיקרית היא לבודד ולנתח ביעילות שברי DNA הקשורים לחלבון בתוך גנומים צמחיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- אפיגנומיקה של כרומטין
- ביולוגיה צמחית
- שינויים בהיסטונים
רקע
- זיהוי שברי DNA הקשורים לחלבון להערכת מצב הכרומטין
- חשיבות השינויים בהיסטונים בוויסות ביטוי גנים
- פיתוח טכנולוגיית CUT&Tag לפרופיל אפיגנומי יעיל
שיטות בשימוש
- בידוד גרעינים שלמים מתאי צמח (עלי כותנה)
- שימוש בנוגדנים ספציפיים לשינויים בכרומטין
- Tn5 טרנספוזאז לפרגמנטציה של כרומטין in situ
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של גרעינים שלמים ופרופיל של טרימתילציה בליזין-4 של היסטון H3
- הכנת DNA משופרת וריצוף באמצעות העשרת PCR
- אימות יעילות הפרוטוקול המעודן של CUT&Tag
מסקנות
- המחקר מדגים בהצלחה פרוטוקול מעודן של CUT&Tag לפרופיל אפיגנומי בצמחים.
- הממצאים תורמים תובנות חשובות למנגנונים המולקולריים של ויסות ביטוי גנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Profiling histone modifications in plant systems enables mechanistic de-risking of epigenetic targets in agricultural biotechnology. The CUT&Tag method provides high-resolution, low-background chromatin profiling from limited starting material, supporting target validation in crop improvement programs. This approach enhances predictive confidence in linking chromatin states to phenotypic outcomes in plant-based discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of histone modification patterns associated with gene expression regulation in plant systems.
- Operational Value: Requires minimal input material (gram-scale tissue) while generating genome-wide binding site data.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of epigenetic mechanisms underlying trait variation and stress response pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative DNA fragment profiles (280-500 bp) enabling comparative analysis of modification states.
- Operational Value: Integrates with standard NGS library construction and PCR amplification workflows.
- Assay Readiness: Generates sequencer-ready libraries with exceptionally low background compared to ChIP-seq.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker discovery by mapping active chromatin marks to functional genomic elements.
- Operational Value: Uses intact nuclei isolation compatible with diverse plant tissue types.
- Predictive Value: Enables risk-adjusted advancement of epigenetic targets in crop development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where epigenetic target identification precedes functional validation and lead optimization in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chromatin-state relationships to transcriptional programs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative epigenomic profiles for compound or genetic perturbation analysis.
- Analytics: Generates high-resolution DNA fragment maps enabling statistical comparison of modification enrichment.
- Translational Research: Connects histone modification patterns to gene expression outcomes in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized chromatin profiling platform applicable across multiple crop species and traits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct mapping of histone modification sites.
- Operational Value: Standardized nuclei isolation and antibody tethering protocol ensures reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological uncertainty in target selection for crop improvement initiatives.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of epigenetic targets based on modification strength and genomic distribution.
Implementation Considerations
- Expertise in plant cell biology and nuclei isolation techniques required.
- Need for centrifugation equipment, magnetic separation, and PCR amplification capabilities.
- Standardization of antibody validation and wash buffer conditions across teams.
- Adaptation considerations for varying nuclei sizes and chromatin accessibility in different plant species.
- Practical limitation: Protocol optimization may be needed for plants with high polysaccharide or polyphenol content.
