זיהוי ישיר של איזולבוגלנדינים ברקמות באמצעות חלבון היתוך D11 scFv-אלקליין פוספטאז ואימונופלואורסנציה

איזולבוגלנדינים היו מעורבים במספר מחלות, במיוחד מחלות לב וכלי דם. פרוטוקול זה פותח כדי לזהות איזולבוגלנדינים ברקמות עם חלבון היתוך אלקליין פוספטאז D11 ואימונופלואורסנציה. שיטות הזיהוי הנוכחיות יקרות או דורשות נוגדן משני עבור תג אלקטרוני.

קשה למצוא נוגדן משני אמין, אך פרוטוקול זה מסיר את שלב הנוגדנים המשניים. לטבול את שקופיות העכבר ורקמות פרפין אנושי משובץ קסילן שלוש פעמים במשך חמש דקות כדי deparrafinize הרקמות. כדי להחזיר לחות לרקמה, לשטוף את הרקמות פעמיים עם 95% אתנול, ולאחר מכן שתי שטיפות עם 70% אתנול ולאחר מכן פעמיים עם אתנול 50% מוכן במים.

שטפו את המגלשות במי מלח חוצצים בתריס עם 0.1% Tween 20 שלוש פעמים על ידי מילוי מחזיק המגלשות ב-TBST. לאחר מכן השליכו את TBST. מניחים את המגלשות במאגר נתרן ציטראט שחומם מראש ודגרים בסיר לחץ המוגדר לארבע דקות בלחץ גבוה, לזמן שליפת אנטיגן כולל של 20 דקות.

בתום הדגירה מסירים את המגלשות מסיר הלחץ ומניחים להן להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. תן שלוש שטיפות מהירות לשקופיות עם TBST כפי שהודגם. חסום את השקופיות על-ידי הוספת 2% BSA מומס ב- TBST.

מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, יש להשליך את מאגר החסימה. הוסף 200 מיקרוליטר של D11 אלקליין phosphatase מוכן TBST לשקופיות ולכסות את שקופיות עם סרט פרפין.

לאחר הדגירה על המגלשות בתא לח במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBST. פתח את השקופיות עם מפתח phosphatase אלקליין קלורימטרי עבור immunohistochemistry, או מפתח phosphatase אלקליין פלואורסצנטי עבור immunofluorescence. שטפו שקופיות פעם אחת עם TBST כדי להסיר את המפתח העודף ולמנוע התפתחות צבע נוספת.

הכתימו את המגלשות בכתם גרעיני HEX אחד למיליליטר שהוכן ב-PBS לאימונופלואורסנציה. לאחר מכן שטפו את המגלשות פעם אחת עם TBST כדי להסיר כתם נגדי עודף. השתמש באמצעי ההרכבה כדי למקם את החלקת הכיסוי על השקופיות שפותחו.

התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ אור הפוך עבור אימונוהיסטוכימיה, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי עבור immunofluorescence. ניתן לבצע ארבעה ניסויי בקרה שליליים כדי לאשר את הספציפיות של צביעת D11 AP עבור איזולבוגלנדין. בניסוי הבקרה השלילית הראשון, דגרו על הרקמות עם D11 AP מדולל ב-TBST, או TBST בלבד.

לאחר מכן יש לדגור על הרקמות עם D11 AP מדולל ותמצית פאריפלזמית חיידקית מדוללת ב-TBST ללא מקשר D11 AP. למבחן התחרותי, הכינו isoLG ו-isoLG המוכנסים לאלבומין בסרום עכבר ביחס מולארי של שמונה לאחד. לדלל את נקודת הגישה D11 מ-1 עד 10 ב-TBST.

לאחר מכן יש לדגור על D11 AP המדולל עם 50 מיקרוגרם למיליליטר איזולבוגלנדין MSA, או MSA ללא ניפוי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הוסף D11 AP עם isolevuglandin MSA או D11 AP עם MSA ללא adducted לרקמות עבור צביעה. השתמש בנוגדן משתנה D20 רלוונטי למקטע שרשרת יחיד כדי להכתים את הרקמות עבור ערכת הבקרה השלילית הסופית.

אימונופלואורסנציה של אבי העורקים בעכברים עם יתר לחץ דם ונורמוטנסיב נחקרה באמצעות פרוטוקול זה. צביעה עם D11 AP הצביעה על ריכוז מוגבר של isoLGs באבי העורקים של עכברים עם יתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II בהשוואה לעכברי הביקורת. D11 AP שימש כדי לזהות את isolevuglandins נוכח ברקמות המעי של חולים אנושיים עם יתר לחץ דם ובני אדם נורמוטנסי.

ברקמות של החולים עם יתר לחץ דם היו ריכוזים גבוהים של איזולבוגלנדינים. רקמות הוכתמו בתמצית pariplasmic וללא D11 AP. הצביעה הבהירה יותר נצפתה ברקמה המוכתמת ב-D11 AP בהשוואה לרקמה המוכתמת בתמצית פאריפלזמית, ואישרה כי הצביעה לא נבעה מהפוספטאז הבסיסי החיידקי הלא מצומד שנמצא בתמצית הפאריפלזמית. בניסוי התחרותי, הרקמה המוכתמת ב-D11 AP שהודגרה מראש עם המתחרה isoLG הראתה צביעה מופחתת, בדומה להכתמה שנצפתה ברקמות עם D11 AP, שמראה ספציפיות ל-D11 AP לאיזולבוגלנדינים.

בבקרה השלילית, צביעת אבי העורקים של העכבר עם D11 AP גרמה להכתמה חזקה בהשוואה ל-D20, מה שמצביע על הספציפיות של D11 AP לאיזולבוגלנדינים באבי העורקים עם יתר לחץ דם. חשוב להשבית כל פוספטאז אלקליין אנדוגני הקיים ברקמה כדי להגביל את כתמי הרקע.