Name: הטיפוח, הגדילה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: למדו את פרוטוקול ההפעלה והגידול של חיידקי חומצה לקטית לבקרת איכות בתהליכי תסיסה. שיטה זו משפרת את חיוניות התרביות ואת יעילות התסיסה באמצעות מדידות צפיפות אופטית וחמצון ללא חמצן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרסום זה התאפשר על ידי מענק מספר NC. X-267-5-12-170-1 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות (NIFA) ובחלקו על ידי NIZO Food Research BV, הולנד, נוסחאות ג'ארו, ארה"ב, והמחלקה למדעי המשפחה והצרכנות ותחנת המחקר החקלאית באוניברסיטת צפון קרוליינה לחקלאות ומדינה טכנית (גרינסבורו, קרוליינה הצפונית, ארה"ב 27411). עבודה זו נתמכה גם, בין השאר, על ידי מענק תוכנית בניית קיבולת מס' 1890 (2020-38821-31113/הצטרפות לפרויקט מס' 021765). עבודה זו נתמכה חלקית גם על ידי משרד החינוך והמדע הבולגרי במסגרת תוכנית המחקר הלאומית 'מזונות בריאים לכלכלה ביולוגית חזקה ואיכות חיים' שאושרה על ידי DCM # 577 / 17.08.2018.

1. חומרים ושיטות כלליים
<ol><li>מקור לקטובצילוס דלברוצקי תת-קרקעי בולגריקוס
	<ol><li>השג זנים של L. bulgaricus ממקורות אמינים. הערה: במחקר זה נעשה שימוש בסך הכל בחמישה (5) זני L. bulgaricus במחקר בקרת האיכות (טבלה 1). שני זנים של L. bulgaricus מיובשים בהקפאה לייצור תעשייתי של מוצרי חלב מותססים סופקו על ידי ד"ר אלברט קרסטנוב, המחלקה לביוטכנולוגיה באוניברסיטה לטכנולוגיות מזון, פלובדיב, בולגריה. שני זנים שבודדו ממוצרי יוגורט מסחריים הזמינים בשוק האמריקאי התקבלו ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת A&amp;T סטייט בצפון קרוליינה, וזן אחד מיובש בהקפאה סופק על ידי ספק C. כל זני LAB נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. זן חיידקי נוסף (Limosilactobacillus reuteri) התקבל ממלאי של -80 מעלות צלזיוס של המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה A&amp;T סטייט.</li>
	</ol></li>
	<li>מדיום מרק תסיסה סטנדרטי L. MRS<ol><li>הכינו את מדיום דה-מן, רוגוסה שארפ (MRS) על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS, ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה (DW).</li>
		<li>יש לחלק 7 מ"ל ו-2 מ"ל מתמיסת ה-MRS המוכנה למבחנות, בהתאמה, ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן לקרר בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>MRS אגר בינוני<ol><li>יש להכין את MRS אגר בינוני על ידי המסה מלאה של 55 גרם MRS ו-0.5 גרם של L-ציסטאין ב-1 ליטר של DW. מוסיפים אבקת אגר (15 גרם), מעקרים את מדיום האגר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מקררים אותו באמבט מים.</li>
		<li>מוזגים את כל חומרי הגלם הטריים לתוך צלחות פטרי סטריליות ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להמשך הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>מולוסטרידיאל בינוני-פירובט מחוזק מותאם (mRCM-PYR)<ol><li>מטב מדיום קלוסטרידיאלי מחוזק על פי Oyeniran et al.13 ו- Nwamaioha ו- Ibrahim18, לסלקטיביות וספירה מדויקת של L. bulgaricus על ידי המסת 10 גרם של פפטון #3, 10 גרם של תמצית בקר, 5 גרם של תמצית שמרים, 5 גרם של נתרן כלורי, 3 גרם של נתרן אצטט, 2 גרם של אשלגן פוספט dibasic, 0.1 גרם של uracil, 0.25 גרם של סידן כלורי, 5 גרם של דקסטרוז, 5 גרם של פרוקטוז, 10 גרם של מלטוז, 2 גרם של נתרן פירובט, 0.2% טווין 80, ו 0.5 גרם של L- ציסטאין ב 1 ליטר של DW.</li>
		<li>התאם את ה- pH הסופי (6.0 ± 0.2) של התמיסה באמצעות 6 N HCl לפני תוספת של 0.008% כחול אנילין ו- 15 גרם אגר. אוטוקלאב את המדיום בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מצננים באמבט מים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות. אחסנו את כל חומרי הגלם הטריים בצלחות פטרי סטריליות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>מלאי גליצרול של תרביות LAB<ol><li>הכינו מלאי גליצרול (50% גליצרול) על ידי דילול 100% גליצרול באותו נפח של DW ועיקור בטמפרטורה של 100°C למשך 30 דקות באמצעות מחזור עיקור יבש. מקררים את מלאי הגליצרול ל-RT ומאחסנים אותם באופן אספטי לשימוש נוסף.</li>
		<li>השתמש בצמיחת חיידקים (מושבה אחת של L. bulgaricus שהושגה באמצעות פרוטוקול QC שפותח) מתרביות לילה.</li>
		<li>פיפטה 500 μL של תרביות הלילה לתוך 50% גליצרול בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל ומערבבים בעדינות אותם יחד. הקפיאו ואחסנו את מלאי הגליצרול המכיל את תרביות LAB בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80°C עד הצורך. הערה: סכימה גרפית של הפרוטוקול לבקרת איכות והפעלה של תרביות LAB מוצגת באיור 1.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>לא</td>
			<td>קוד מוצר</td>
			<td>לדוגמה</td>
			<td>מקור</td>
			<td>הרכב החיידקים כפי שמסומן1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>S9</td>
			<td>זן תעשייתי טהור</td>
			<td>בולגריה</td>
			<td>Lb. בולגריקוס</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>ל"ב6</td>
			<td>זן תעשייתי טהור</td>
			<td>בולגריה</td>
			<td>ל"ג בולגריקוס,</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>ATCC 11842</td>
			<td>זן תעשייתי טהור</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lb. בולגריקוס</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>דאו</td>
			<td>יוגורט</td>
			<td>ארצות הברית</td>
			<td>Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>E22</td>
			<td>יוגורט</td>
			<td>ארצות הברית</td>
			<td>Lb. בולגריקוס, תרבות חיה אחרת</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>ראוטרי</td>
			<td>יוגורט</td>
			<td>ארצות הברית</td>
			<td>לימוסילקטובצילוס ראוטרי</td>
		</tr><tr><td colspan="5">1ק"ג =לקטובצילוס</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: זנים פרוביוטיים. הטבלה מפרטת את הזנים הפרוביוטיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.
2. פרוטוקול להפעלה ובקרת איכות של תרביות LAB
<ol><li>קח את מלאי הגליצרול המוכן של זני LAB (בצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל) מהמקפיא האולטרה-נמוך במיוחד של -80 מעלות צלזיוס, ואל תאפשר להם להפשיר לפני השימוש.</li>
	<li>נקו וחטאו את פתח צינורות הצנטריפוגה ב-70% אלכוהול, ומערבלים בעדינות לפני השימוש.</li>
	<li>פיפטה על 250 μL (0.25 מ"ל) של תרבית LAB המניות מצינורות צנטריפוגה לתוך מבחנות MRS טריות 2 מ"ל.</li>
	<li>מערבלים בעדינות, עושים פרפילם למבחנות, ומדגרים אותם באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.</li>
	<li>קח כ-500 μL (0.5 מ"ל) מהתרביות הגדלות בן לילה ממבחנות MRS של 2 מ"ל למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות, ודגירה אנאירובית שלהן למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.</li>
	<li>הערך את הגידול המיקרוביאלי על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) או הצמיחה של התרביות ב-610 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ותעד תוצאות מקובלות בין 0.7 ל-0.9.</li>
	<li>פסו את תרביות הלילה מצינורות MRS של 7 מ"ל על צלחות אגר MRS ו- MRCM-PYR ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך 72 שעות ב-42 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בחרו מושבות מבודדות מצלחות האגר, העבירו אותן למבחנות MRS טריות של 7 מ"ל, מערבולות עדינות, ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.</li>
	<li>אחסנו את צלחות האגר המכילות את הזנים המבודדים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך שבוע.</li>
	<li>למדוד ולאשר את ה-OD (בין 0.7 ל-0.9) ממבחנות MRS של 7 מ"ל של תרביות LAB שבודדו מהלוחות המפוספסים ב-610 ננומטר ולהשתמש בהם כתרביות עבודה לכל הניסויים הקשורים.</li>
	<li>בצע דילול פי עשרה (מדולל סדרתי) של תרביות LAB שגודלו ממבחנות MRS אחרונות של 7 מ"ל באמצעות 9 מ"ל של מי פפטון (חיץ פיזיולוגי) כדי להשיג יחס של 1:10.</li>
	<li>לבסוף, קח כ 250 μL (0.25 מ"ל) מדילולים סדרתיים מתאימים עבור כל ניסויי התסיסה.</li>
	<li>הפעל את המרק המכיל זנים (250 μL) משלב 2.12 על ידי העברתם למרק MRS טרי של 7 מ"ל ודגירתם באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.</li>
	<li>המשך על ידי חזרה על שלבים 2.6-2.12 כדי להבטיח צמיחת תאים בת קיימא ומעולה מתרביות LAB. הערה: כל זני L. bulgaricus הופעלו בציר MRS שהוכן זה עתה ולאחר מכן דוגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות על מנת להגיע לצפיפות אופטית (OD610 ננומטר) של צמיחת חיידקים בין 0.7 ל-0.9. צמיחת חיידקים נמדדה באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV ב-610 ננומטר. ערכי ה-pH של תרביות הלילה היו בטווח של 3.5 עד 5.3 כתוצאה מייצור חומצה לקטית, תוצר סופי אורגני של תסיסת LAB. נהלי בטיחות כגון זרימת אוויר תקינה במכסה המנוע ומניעת כוויות במהלך השימוש במבער הבונזן הודבקו ונצפו.</li>
</ol><img alt="דיאגרמת תהליך תרבית LAB; הכנת מרק MRS, דגירה, מדידת צפיפות אופטית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63314/63314fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סכימה גרפית של הפרוטוקול להפעלת תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB). התוכנית מספקת פרטים ואת המכשירים הבסיסיים הדרושים לטיפול והפעלה של זני תרבית LAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63314/63314fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<ol><li>Karakas-Sen, A., Karakas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification+and+technological+properties+of+lactic+acid+bacteria+from+raw+cow+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk.</a> Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).</li>
<li>Martin, R., Langella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+health+concepts+in+the+probiotics+field%3A+Streamlining+the+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1047(2019).</li>
<li>Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+probiotic+evaluation+of+potential+antioxidant+lactic+acid+bacteria+isolated+from+idli+batter+fermented+with+Piper+betle+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves.</a> International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).</li>
<li>Ayivi, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria%3A+Food+safety+and+human+health+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Dairy%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications.</a> Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).</li>
<li>Quinto, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+lactic+acid+bacteria%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Probiotic lactic acid bacteria: A review.</a> Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).</li>
<li>Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+media+for+lactic+acid+bacteria+used+in+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products.</a> Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).</li>
<li>Bintsis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria+as+starter+cultures%3A+An+update+in+their+metabolism+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Aims+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics.</a> Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).</li>
<li>Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+and+preconditioning+on+survival+of+Lactobacillus+delbrueckii+subspecies+bulgaricus+ND02+during+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).</li>
<li>Aryana, K. J., Olson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+100-year+review%3A+Yogurt+and+other+cultured+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products.</a> Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).</li>
<li>Kandil, S., El Soda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+freezing+and+freeze-drying+on+intracellular+enzymatic+activity+and+autolytic+properties+of+some+lactic+acid+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains.</a> Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).</li>
<li>Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cell+density+cultivation+of+Saccharomyces+cerevisiae+with+intensive+multiple+sequential+batches+together+with+a+novel+technique+of+fed-batch+at+cell+level+%28FBC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC).</a> Processes. 8 (10), 1321(2020).</li>
<li>Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonies+in+solid+media+and+foods%3A+A+review+on+their+growth+and+interactions+with+the+micro-environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1284(2015).</li>
<li>Oyeniran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+reinforced+clostridial+medium+for+the+isolation+and+enumeration+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus+in+a+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture.</a> Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).</li>
<li>Iguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+repeated+subculturing+and+prolonged+storage+at+room+temperature+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3A+H7+on+pulsed-field+gel+electrophoresis+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).</li>
<li>Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+limitations+and+challenges+with+lactic+acid+bacteria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review.</a> Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+bile+salt+tolerant+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+2007+National+Conference+on+Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri.</a> Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).</li>
<li>Gyawali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+extraction+techniques+for+maximum+recovery+of+%CE%B2-galactosidase+from+the+yogurt+bacterium+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).</li>
<li>Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+medium+for+the+enumeration+and+differentiation+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התוצאות של כל הזנים שהוערכו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות וללא שימוש בפרוטוקול היו זהות, ולכן הוצגו תוצאות המקושרות לזנים בלבד (S9 ו-LB6). זני ה-LAB המופעלים היו בעלי צמיחת תאים מעולה שהתאפיינה בעוצמה גבוהה של ביומסה תאית, ולכן גרמה להופעה עכורה של המרק התסיסתי MRS במבחנה11. צמיחת התאים שנצפתה לאחר הפעלת התרבית ניכרה בין 12 שעות ל -16 שעות בטמפרטורה תסיסה אנאירובית של 42 מעלות צלזיוס. כמו כן אושר כי זני ה-LAB שהופעלו על סמך פרוטוקול זה עברו באופן רציף את המורפולוגיות של המושבות שלהם כתוצאה מהליך ר...

חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם קבוצה של חיידקים מגוונים באופן ייחודי שיש להם פוטנציאל תעשייתי. זנים השייכים ל-Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ו-Streptococcus thermophilus משמשים בעיקר כתרביות חלב למוצרי חלב מותססים כגון יוגורט1. זני LAB נבחרים מסווגים גם כפרוביוטיקה מכיוון שהם מעניקים יתרונות בריאותיים לבני אדם כאשר המינונים ניתניםכראוי 2. חיידקי חומצה לקטית הם גם מיקרואורגניזמים גראם חיוביים, לא יוצרי נבגים, לא נושמים אך אירוסובלניים המאופיינים בדרך כלל על ידי ייצור חומצה לקטית כמוצר תסיסה מרכזי. LAB גם מסנתזת מטבוליטים חיוניים, לדוגמה, חומצות אורגניות, בקטריוצינים ותרכובות אנטי-מיקרוביאליות אחרות3 שיכולות לעכב ספקטרום רחב של פתוגנים המועברים במזון4. חומצה לקטית, תוצר סופי עיקרי של קטבוליזם פחמימות ותוצר לוואי של תסיסת LAB, היא מטבוליט אורגני בעל תכונות אנטי-מיקרוביאליות והוא עשוי להיות שימושי ליישומי שימור ביולוגי של מזון 3,5,6. יתר על כן, החומצות האורגניות המיוצרות על ידי LAB מקנות את הטעם, המרקם והארומה של המזונות, ובכך משפרות את התכונות האורגנולפטיות הכלליות שלהם 5,6. הדרישות התזונתיות הייחודיות של LAB יחד עם האופי שלהן בכל מקום, מאפשרות בסופו של דבר לחיידקים לשגשג בקלות בסביבות שונות כגון מזונות המבוססים על מוצרי חלב, מזונות מותססים, ירקות, כמו גם במעיים האנושיים7.
יש ביקוש הולך וגובר לתרביות התחלתיות מ- LAB לייצור יוגורט ויישומי חלב רבים ומגוונים8,9, ולכן יש לדבוק בתשומת לב קריטית ובטכניקות מדעיות מבוססות, בטיפוח זני LAB, כמו גם בהפעלת זנים ליופיליים ומבודדים כאחד, שכן פעילות זו חיונית לביצועי תסיסה משופרים. לפיכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון עוסקת באופן פעיל בפיתוח טכנולוגי מתאים המיועד להפעלה, גידול מעולה ותסיסה האופייניים לזני LAB המבודדים ממוצרי חלב מותססים, כמו גם מתרביות התחלתיות תעשייתיות המועסקות בייצור יוגורט. יתר על כן, ראוי לציין כי זני תרביות LAB המיוצרים באופן תעשייתי עוברים פעילויות משמרות כגון ייבוש בהקפאה ואחסון קפוא, הגורמים ללחץ ופגיעה בתאים, כתוצאה מתהליך הלם הקור שהם נתונים לו10. כדי להגביל, את אתגרי הכדאיות ולשפר את הפונקציונליות של זני LAB המתקבלים ממוצרי מזון מבודדים או ממוצרים מיובשים בהקפאה, חשוב להפעיל כראוי תרביות אלה כצורה של בקרת איכות כדי לשפר את המאפיין התסיסתי שלהם8. במחקר זה, המטרה הייתה לפתח פרוטוקול בקרת איכות פנימי להפעלה וצמיחה של זני תרבית L. delbrueckii subsp. bulgaricus שבסופו של דבר קידמו צמיחת LAB בת קיימא, כמו גם שיפרו את ביצועי התסיסה ואת הפונקציונליות המטבולית של זני LAB. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בסופו של דבר (באמצעות מדיית גידול אופטימלית ותנאי גידול מתאימים) לטיפוח זני LAB אחרים למחקר תסיסה, כמו גם למטרות תעשייתיות או לפעולות עיבוד ביולוגי. לפיכך, פרוטוקול הפעלה ובקרת איכות זה של LAB יבטיח קבלת תרביות התחלתיות של מוצרי חלב בני קיימא ומתאימות, בעלות פוטנציאל לתפקד עבור יישומים מגוונים בתעשיית החלב והמזון העולמית.

<table><tbody><tr><td>אנילין בלו</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>R21526</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>תמצית בקר</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>50-197-7509</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1422-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C79-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>דקסטרוז פישר</td><td>נטול מים</td><td>BP350500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>D-פרוקטוז</td><td>ACROS Organics</td><td>AC161355000</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>אבקת אגר</td><td>Difco Difco</td><td>DF0812-07-1</td><td>2 ק"ג</td></tr><tr><td>אגר TPY</td><td>Difco</td><td>211921</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>05-402-12</td><td>2 מ"ל</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>PI17904</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>אינקובטור CO2 אינפרא אדום</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 11842</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bulgaria</td><td>S9</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bulgaria</td><td>LB6</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)</td><td>DAW</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)</td><td>E22</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Biogai, Raleigh / המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון (NCATSU)</td><td>RD2</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6852-25G</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>מלטוז מונוהידראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M75-100</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>מרק MRS</td><td>Neogen</td><td>50-201-5691</td><td>5 ק"ג</td></tr><tr><td>פפטון מס '3</td><td>Hach</td><td>50-199-6719</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)</td> <td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>50-712-761</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן אצטט טריהידרט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S220-1</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-1</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP356-100</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>מבחנות עם מכסי בורג מרופדים גומי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>FB70125150 25 x 150 מ"מ</td></tr><tr><td>טווין 80</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>T164-500 500</td><td>מ"ל</td></tr><tr><td>מקפיא נמוך במיוחד</td><td>So-Low</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>ACROS Organics</td><td>AC157301000</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר גלוי UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Evolution 201</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td> Fisher Scientific תמצית שמרים פישר <td>סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1422-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>T08204K7</td><td>4 ליטר</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (6N (מאושר), פישר כימיקלים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; SA56-500</td><td>500 מ"ל</td></tr></tbody></table>

הטיפוח, הגדילה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות

The Cultivation, Growth, and Viability of Lactic Acid Bacteria: A Quality Control Perspective

חיידקי חומצה לקטית (LAB) הם תרביות חלב חיוניות המשמשות באופן משמעותי לייצור מוצרי חלב מותססים כגון יוגורט וגבינה. LAB מייצרים בעיקר חומצה לקטית כתוצר סופי עיקרי של תסיסה, והם מסנתזים מטבוליטים חשובים המקנים את המאפיינים האורגנולפטיים של מוצרי מזון מותססים. LAB הם חיידקים חזקים שמשגשגים בסביבות רבות כאשר דרישות תזונתיות נאותות מתמלאות. הדרישה לתרביות התחלתיות מעולות של LAB ליישומי תסיסה בתעשיית המזון ומוצרי החלב, הביאה לצורך לספק תרביות בנות קיימא ופעילות לכל פעולות העיבוד הביולוגי. לפיכך, פיתוח פרוטוקול סטנדרטי להבטחת הכדאיות והפונקציונליות המשופרת של תרביות LAB במעבדה, כמו גם בסביבות עיבוד חלב, הוא קריטי מאוד. במתן מענה לחששות הקשורים להחייאת תאי תרבית LAB חלשים, לחוצים ופצועים, פרוטוקול המתווה בצורה חיה צעדים בולטים להתאוששות, שיפור התחדשות התאים ושיפור התפקוד המטבולי של זני LAB הוא בעל חשיבות עליונה. גם השמירה על טוהר התרבית, הפונקציונליות והכדאיות של תרביות התחלתיות LAB היא קריטית. לכן, הקפדה על הנחיית פרוטוקול ייחודית תביא לקידום ביצועי התסיסה עבור זני LAB רבים המוקדשים לתהליכי תסיסה וביוטכנולוגיה. כתוצאה מכך, המעבדה למיקרוביולוגיה וביוטכנולוגיה של מזון באוניברסיטת צפון קרוליינה לחקלאות וטכנולוגיה פיתחה פרוטוקול סטנדרטי להפעלה ובקרת איכות של זני LAB נבחרים, שהביא לזני תרבית LAB פונקציונליים וברי קיימא ביותר המשמשים למחקר תסיסה. ההתאמה וההמלצה של פרוטוקול כגון זה לשימוש בתעשיית החלב והמזון תסייע להבטיח את הכדאיות והפונקציונליות של LAB עבור יישומים רבים.

גידול התאים של זני ה-LAB המוערכים שטופחו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות היה שונה באופן משמעותי (P &lt; 0.05) מהזנים שטופחו ללא פרוטוקול סטנדרטי זה. פרוטוקול QC הן עבור L. bulgaricus והן עבור L. reuteri נקט בגישה רב-תרבותית (תת-תרבות שלוש פעמים לפני פסים על לוחות אגר), בעוד שהליך הבקרה נעשה רק פעם אחת כאשר כל התנאים האחרים נשמרו קבועים. גידול המושבה היה גם גבוה יותר ומוגדר היטב על לוחות המדיה לגידול שטופחו באמצעות פרוטוקול QC סטנדרטי זה. זה אישר את היעילות של הפרוטוקול בהבטחת צמיחת LAB משופרת באמצעות חלוקת...

הערכת בקרת האיכות של תרביות חיידקי חומצה לקטית (LAB) אושרה כדרך יעילה לשפר את הכדאיות והפונקציונליות של זני LAB להליכי תסיסה. כדי לחזק טענה זו, פיתחנו פרוטוקול המבהיר כיצד תרביות LAB מופעלות ומעובדות לצורך תהליכי תסיסה ועיבוד ביולוגי.

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as ...

הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מבטיח טוהר כבדיקת בקרת איכות. הוא גם מקדם ביצועי תסיסה חמורים ועקביות של תפוקה בתסיסה של חיידקי חומצה לקטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לשפר את ביצועי התסיסה של חיידקי חומצה לקטית באמצעות טוהר התא, הכדאיות והפונקציונליות.טכניקה זו היא ידידותית למשתמש וניתן לבצע בקלות על ידי כל אדם בשל השימוש בציוד בסיסי בלבד ללא דרישות טכניות רבות. פיליפ יבואה הוא עוזר המחקר שלנו לתואר שני והוא ידגים את ההליך. כדי להתחיל, קח את מלאי הגליצרול המוכן של חיידקי חומצה לקטית, או זני LAB, בשני מיליליטר צינורות צנטריפוגה מהמקפיא האולטרה-נמוך מינוס 80 מעלות צלזיוס.אין לאפשר להם להפשיר לפני השימוש. נקו וחטאו את פתח צינורות הצנטריפוגה ב-70% אלכוהול ומערבלים בעדינות לפני השימוש. פיפטה על 250 מיקרוליטרים של תרבית LAB המניות מצינורות הצנטריפוגה ועד מבחנות MRS טריות של שני מיליליטר.מערבלים בעדינות את המבחנות, עושים להן פרפרם, ומדגרים אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. לאחר מכן, קחו כ-500 מיקרוליטרים מהתרביות שגודלו בן לילה משתי מבחנות MRS של מיליליטר ועד מבחנות MRS טריות של שבעה מיליליטר, ערבלו אותן והדגירו אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. הערך את הגידול המיקרוביאלי על ידי מדידת הצפיפות האופטית או הצמיחה של התרביות ב-610 ננומטר עם ספקטרופוטומטר גלוי UV ותעד תוצאות מקובלות בין 0.7 ל-0.9.פזרו את תרביות הלילה מצינורות MRS של שבעה מיליליטר על צלחות אגר MRS ו- MRCMPYR ודגרו אותן באופן אנאירובי במשך 72 שעות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. בחרו את המושבות המבודדות מלוחות האגר, העבירו אותן למבחנות MRS טריות של שבעה מיליליטר, מערבולות עדינות, ודגרו אותן באופן אנאירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. אחסנו את צלחות האגר המכילות את הזנים המבודדים בארבע מעלות צלזיוס במקרר למשך שבוע.לאחר מכן, מדוד ואשר את הצפיפות האופטית ממבחנות MRS של שבעה מיליליטר של תרביות LAB שבודדו מהלוחות המפוספסים ב-610 ננומטר והשתמש בהם כתרביות עבודה לכל הניסויים הקשורים. השתמש בתשעה מיליליטר של מי פפטון כדי לבצע זיהומים פי עשרה של תרביות LAB שגדלו משבעת מבחנות MRS האחרונות של מיליליטר כדי להשיג יחס של 1 עד 10. קחו כ-250 מיקרוליטרים מההזיות הסדרתיות המתאימות לכל ניסויי התסיסה והפעילו את המרק המכיל את הזנים על ידי העברתם למרק MRS טרי של שבעה מיליליטר והדגירה שלהם באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.חזור על השלבים כדי להבטיח צמיחת תאים בת קיימא ומעולה מתרביות LAB. מורפולוגיה של תאים של זני לקטובצילוס בולגריקוס S9 ו-LB6 שטופחו באמצעות פרוטוקול בקרת האיכות וזני לקטובצילוס בולגריקוס S9 שטופחו ללא פרוטוקול בקרת האיכות מוצגים כאן. הזנים היו מפוספסים במשולשים והודגרו באופן אנאירובי בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.בעת ניסיון הליך זה, הקפד לחטא את צינורות תרבית המלאי מהמקפיא עם 70% אלכוהול כדי למנוע זיהום צולב. מדידת צפיפות אופטית של תרביות גדילה צריכה להיות תמיד בין 0.7 ל-0.9. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשיג תסיסות מעבדה יעילות או פעולות עיבוד ביולוגי עם שימוש מעולה בתרבית.

the-cultivation-growth-viability-lactic-acid-bacteria-quality-control

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Ayivi, R. et al., הטיפוח, הצמיחה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את השיטה לשחזור חיידקי חומצה לקטית בלחץ קר ממאגר גליצרול קפוא, שחזור כדאיות חיידקים באמצעות דגירה אנאירובית ובידוד מושבות פעילות להרחבת תרבית.

תחייה וצמיחה של חיידקי חומצה לקטית

פרוטוקול ייצור מתואר לייצור בקנה מידה קטן של משקה חלב מותסס פרוביוטי בעזרת תרבית התחלה חיידקית חדשה.

פרוטוקול הפקה חדשנית לייצור בקנה מידה קטן של מזונות מותססים פרוביוטיים

הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.

ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים

כמו אורגניזמים אנאירובית מחייב אינם מסוגלים לצמוח על החשיפה לחמצן, השימוש של טכניקות culturing אנאירובית הוא הכרחי. כאן, אנו להדגים שיטה פשוטה ויעילה לטפח תרבות מעורבת נגזר צמח ביוגז מפני התקשורת הכנה גז וכימות חומצות שומן נדיף.

הכנה בינונית לטיפוח מיקרואורגניזמים בתנאים אנאירובית/אנקסימית בלבד

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הכרוכים בייצור ואפיון פיסיקוכימי של מוצר פרוביוטי מיובש בהתזה.

תהליך פיתוח לייבוש בהתזה של חיידקים פרוביוטיים והערכת איכות המוצר

הפרוטוקול מציג שתי מתודולוגיות לשיפור הבידוד של חיידקי מעיים אנאירוביים. הראשון מתמקד בבידוד של מגוון רחב של חיידקים באמצעות אמצעי תרבית שונים. השני מתמקד בשלבי הטיפוח של קבוצת חיידקים מסוימת, אולי הטמעת מיו-אינוסיטול, כדי להבין באופן מלא את משמעותה האקולוגית.

אסטרטגיות לשיפור טיפוח חיידקים אנאירוביים ממערכת העיכול של עוף

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

קביעת מספר התאים בתרבית חשוב סטנדרטיזציה של תנאים התרבות בביצוע ניסויים quantitation מדויק. בסרטון זה אנו מדגימים כיצד תאים נספרים באמצעות hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

אנו מדגימים את השימוש microarrays DNA עבור פרופיל הביטוי של מערכת העצבים. אנו מתארים לשלוט RNA איכות, תיוג המדגם, הכלאה מערך סריקה.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מבחני כדאיות התא ביטוי הקרינה באמצעות Cytometer תמונה מבוסס טלי.

הערכת הביטוי GFP ואת הכדאיות שימוש Cytometer תמונה מבוסס טלי

למדו את פרוטוקול ההפעלה והגידול של חיידקי חומצה לקטית לבקרת איכות בתהליכי תסיסה. שיטה זו משפרת את חיוניות התרביות ואת יעילות התסיסה באמצעות מדידות צפיפות אופטית וחמצון ללא חמצן.

הטיפוח, הגדילה והכדאיות של חיידקי חומצה לקטית: נקודת מבט של בקרת איכות

גלה סרטונים נוספים