פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

Capture Hi-C מאפשר לפענח את ארגון הכרומטין התלת-ממדי של אזור גנומי בגודל מגה-בסיס ברזולוציה גבוהה. עם Capture Hi-C, רזולוציה גבוהה יותר וספציפיות אלל מושגות תוך שיפור יעילות הזמן והמחיר המשתלם של הטכניקה. היישום של Capture IC על מערכות מודל שונות, סוגי תאים ונופי כרומטינים מווסתים התפתחותית במצבים בריאותיים ופתולוגיים עשוי להקל על הבנתנו את יחסי הגומלין בין טופולוגיית גנום לבקרת גנים.

כדי להתחיל, טריפטוניז ולספור תאים מלוח הבקרה שהוכן במיוחד לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. כלול צביעת כדאיות כדי לקבוע את אחוז התאים בני קיימא. מתוך ספירת תאים זו, הערך את המספר הכולל של תאים בלוח שהוכנו להצלבה.

מוציאים את מדיום התרבית מהלוחות שהוכנו לקרוסלינקינג ומחליפים אותו בתמיסת הקיבוע. יש לתקן למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין בשייקר. להרוות את התגובה הקבועה על ידי הוספת PBS גליצין מולארי 2.5 לריכוז סופי של 0.125 טוחנות.

הוסף 530 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי PBS ל 10 מיליליטר בצלחת 10 ס"מ. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, מערבבים בעדינות על שייקר. מעבירים את הצלחות לקרח ודגרים 15 דקות נוספות על קרח תוך ערבוב עדין על שייקר.

הסר את תמיסת הקיבוע מהתאים על ידי מזיגה לתוך כדי להבטיח טיפול מהיר. שטפו את הצלחת בקוטר 10 ס"מ במהירות פעמיים עם חמישה מיליליטר של גליצין טוחנת קר 0.125 PBS כדי לשטוף את הפסולת והתאים המתים. הוציאו את הנוזל מהצלחת על ידי מזיגה לתוך כדי להבטיח טיפול מהיר.

הוסף חמישה מיליליטר של גליצין טוחנת קר 0.125 PBS לצלחת 10 ס"מ. במהירות לגרד את התאים מן הצלחת באמצעות מגרד תא פלסטיק. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר קרירה מראש באמצעות פיפטה סרולוגית.

שטפו את הצלחת פעמיים בחמישה מיליליטר גליצין טוחנת קר 0.125 PBS והוסיפו את תרחיף התא לצינור הצנטריפוגה החרוטית. סובבו כלפי מטה ב-480 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant על ידי שאיפה עם מערכת שאיפות benchtop.

להשעות מחדש את התאים aliquot 500 מיקרוליטר של השעיית התא לתוך מספר מחושב של 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות צינורות. יש לסובב כלפי מטה בטמפרטורה של 480 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחסן את כדורי התאים היבשים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. עבור ליזיס התא, להפשיר את הכדורים הקפואים על קרח.

מכינים 1.5 מיליליטר של חיץ ליזה במים. מוסיפים 600 מיקרוליטר של חיץ הליזיס הקר ומרחפים היטב על קרח. סובב למטה ב 2, 655 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והסר את supernatant באמצעות מערכת שאיפה benchtop.

השהה מחדש ב 100 מיקרוליטר של 0.5% SDS. לאחר הדגירה ב-62 מעלות צלזיוס מסתחררים ב-1400 סל"ד במשך 10 דקות, מוסיפים 290 מיקרוליטר מים ועוד 50 מיקרוליטר של 10% טריטון X 100, ומערבבים היטב, תוך הימנעות מבועות אוויר. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך הסתחררות של 1400 סל"ד למשך 10 דקות לפני הוספת 50 מיקרוליטר של חיץ צינור DPN 10 X ולהפוך את הצינור כדי לערבב.

קח 50 מיקרוליטר של DNA מעוכל לבקרת איכות לתוך צינור נפרד. אל תשכח לקחת את דגימת הבקרה מעוכל. לעיכול DPN2, יש להוסיף 10 מיקרוליטר של ריכוז גבוה DPN2 ולערבב על ידי היפוך.

דוגרים על הדגימות והבקרה הלא מעוכלת במערבל תרמי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ומסתחררים במהירות של 1400 סיבובים לדקה במשך יותר מארבע שעות. עבור קשירה והיפוך של cross-linking, לקחת 50 מיקרוליטר של DNA מעוכל קשור לבקרת איכות בצינור נפרד. אחסנו את הבקרות הלא מעוכלות והלא קשורות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

מוסיפים 800 מיקרוליטר קוקטייל קשירה. דוגרים ב 16 מעלות צלזיוס, מסתחררים ב 1000 סיבובים לדקה במשך הלילה. לטיהור DNA, העבירו את הדגימות על הקרח לצינורות צנטריפוגות חרוטיות של 15 מיליליטר והוסיפו שני מיליליטר מים, 10.5 מיליליטר אתנול קר כקרח ו-583 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט טוחן.

הוסף 200 מיקרוליטר של אתנול קר כקרח, 10.8 מיקרוליטר של נתרן אצטט, ומיקרוליטר אחד של המשקע לבקרות איכות לא מעוכלות וקשורות. יש לדגור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות לפחות עד הלילה. סובבו את צינורות ה-15 מיליליטר ב-2200 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.

יש להסיר בזהירות אתנול ולייבש את הדגימות והבקרות באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. אין לייבש יתר על המידה. השהה מחדש את הדגימות והבקרות ב -100 מיקרוליטר ו -20 מיקרוליטר מים, בהתאמה.

לבקרת איכות של הכנת תבנית 3C, יש להעמיס 100 עד 200 ננוגרם מכל דגימה וכל בקרה על ג'ל 1% agros 1XTBE. לאחר מכן כדי לבצע העשרת מטרה לריצוף מולטיפלקס קצה מנוקד, קח ארבעה מיקרוגרם של תבנית 3C, השהה אותה מחדש ב -130 מיקרוליטר מים עבור כל תגובת לכידה. סוניק את הדגימה ולהמשיך את ההכנה עם שלושה מיקרוגרם של DNA גזוז.

כדי להכליא את דגימות ה-DNA המוכנות לגשושיות ה-RNA הספציפיות למטרה, השתמשו ב-750 ננוגרם של דגימות דנ"א בנפח סופי של 3.4 מיקרוליטר, והתוצאה היא ריכוז התחלתי של 221 ננוגרם למיקרוליטר. השתמש בריכוז ואקום מהיר במידת הצורך כדי להשיג את הנפח הסופי של 3.4 מיקרוליטר. עבור דגימות מחדש מושעה ב 10 מיקרוליטר, 15 עד 20 דקות של ריכוז מספיק.

לדגור על תערובת ההכלאה במשך 16 עד 18 שעות ב 65 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם ב 105 מעלות צלזיוס, על פי הוראות היצרן. כדי ללכוד את מקטעי הקשירה הממוקדת, הוסף סטרפטיביד בחרוזים מצומדים לדגימה ההיברידית של הבדיקה. לבסוף, כדי להכין את הדגימות לריצוף מולטיפלקס, יש להמשיך את הפרוטוקול בהתאם למערכת העשרת המטרה המשמשת במחקר זה לריצוף זוגי ומרובה.

הרזולוציה של מפת האינטראקציה Capture Hi-C מאפשרת זיהוי של שני תחומים קטנים יותר ב-Tsix-tad המכיל את מקדם הלוקוס Tsix. זה לא הושג בעבר עם 5C. יתר על כן, מבנים תת-קרקעיים אחרים, כגון לולאות מגע, נראים בבירור מנתוני Capture Hi-C, כגון הלולאה בין Xist ל-FTX, שזוהתה בעבר עם Capture C והלולאה בין Xist ל-Xert שזוהתה לאחרונה באמצעות פרוטוקול דומה עבור Capture Hi-C.

ניתן גם למפות מגעים אחרים בצורה מדויקת יותר בשל הרזולוציה המוגברת של פרופילי Capture Hi-C, כגון אלה היוצרים את נקודות הקשר החמות הידועות בתוך Tsix-tad בין Linx, Chic1 ו- Xite loci. בהשוואה לנתוני Hi-C המוצגים, Capture Hi-C איפשר עלייה של פי ארבעה ברזולוציה, אך הוא דרש רק רבע מעומק הרצף. חשוב מאוד לא לשכוח לקחת 50 מיקרוליטר של דגימות DNA לא מעוכלות ולא קשורות כבקרת איכות להכנת תבנית 3C.