ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

פרוטוקול זה מתאר שיטות המאפשרות לחוקרים לבטא CDNA או SIRNA באורותל שלפוחית השתן הטבעי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הפשטות היחסית שלה, היכולת לבטא cDNAs, siRNAs באורותל ביעילות גבוהה, ובתוך פרק זמן קצר יחסית. החלק הקשה ביותר בטכניקה זו הוא הצנתור.

עם זאת, קל יחסית לשלוט בטכניקה הכוללת לאחר שנלמדה. מי שידגים את ההליך יהיה ג'ובאני רואיז, מומחה מחקר IV במעבדה שלי. כדי להתחיל, הניחו את העכבר המורדם על כרית חימום ליד קונוסים באף.

יש לשמור על בעל החיים תחת הרדמה למשך כל תקופת הפרוטוקול. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין עם צביטת בוהן. כדי למנוע החדרת אוויר לשלפוחית השתן, מלא את חלק הצנתר הפלסטי של צנתר IV ואת הרכזת המשויכת אליו עם PBS סטרילי באמצעות פיפטה או מזרק העברה סטרילית.

כאשר בעל החיים במצב שכיבה מקלון את בשר השופכה החיצוני עם 70% אלכוהול. לאחר מכן תפסו בעדינות את הרקמה היוצרת את בשר השופכה החיצוני והרחיבו אותו אנכית הרחק מהחיה באמצעות מלקחיים עדינים. מחדירים את הצנתר הסטרילי לתוך הבשר החיצוני.

בעזרת היד השנייה מחדירים בזהירות את הצנתר במאונך כשלושה עד ארבעה מילימטרים לתוך בשר השופכה. לאחר מכן מורידים את הצנתר המוחדר לבשר החיצוני לכיוון זנב החיה, מה שמקל על כניסתו לחלק של השופכה שעובר מתחת לעצם הערווה ובסופו של דבר לתוך שלפוחית השתן. יש לאפשר לשתן בשלפוחית השתן לדלוף החוצה.

הסר שאריות שתן על ידי ביצוע התמרון של Crede על ידי עיסוי ולחץ עדין כלפי מטה על בליטת שלפוחית השתן באזור הבטן התחתונה. כדי להפוך את השתן פתוח להתמרה, שטפו את העכבר או שלפוחית השתן של החולדה על ידי חיבור מזרק סטרילי של מיליליטר אחד מלא PBS למרכז הצנתר. הזריקו 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לשלפוחית השתן של העכבר.

לאחר ניתוק המזרק מהתאמת הצנתר, יש לאפשר ל-PBS להתנקז. להחדיר 100 מיקרוליטר של 0.1%N-דודציל-בטא-D-מלטוזיד מומס PBS ומסנן 0.2 מיקרומטר מעוקר לתוך שלפוחית העכבר באמצעות מזרק סטרילי של מיליליטר. שמור את N-dodecyl-beta-D-maltoside בשלפוחית השתן במשך 10 דקות על ידי השארת המזרק במקומו.

הסר את N-דודציל-בטא-D-מלטוזיד משלפוחית השתן על ידי ניתוק המזרק ולאפשר לו להתנקז החוצה. כדי להכניס את הנגיף לשלפוחית השתן לחבר מזרק סטרילי של מיליליטר לרכזת הצנתר ולהחדיר 5, 000, 000 עד 100, 000, 000 IVP של אדנווירוס מדולל ב 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי עבור עכברים, או 450 מיקרוליטר עבור חולדות לתוך שלפוחית השתן. לאחר 30 דקות, נתקו את המזרק ואפשרו לתמיסת הנגיף לפנות את שלפוחית השתן אל פד חד פעמי.

יש להכתים כל תמיסת וירוס שארית עם מגבון סופג תוך השלכת הפד ולנגב בפסולת מסוכנת ביולוגית. על מנת לאפשר לחיה להתאושש, להפסיק את זרימת isoflurane. אפשרו לבעל החיים להתאושש ולהיות נייד לחלוטין לפני החזרתו לכלוב שלו, במיוחד אם בעלי החיים נמצאים בקבוצה.

לנתח את ההשפעות של ביטוי טרנסגנים 12 עד 72 שעות לאחר הטיפול באמצעות שיטות כגון mRNA באתרו הכלאה, כתם מערבי, או immunofluorescence. ניתוח כתם מערבי של ליזטים של דרכי השתן גילה ביטוי הורמון גדילה אנושי המתויג V5 באורותל של שלפוחית השתן, אך לא באלה שלא עברו טרנספורמציה. הביטוי אושר גם על ידי immunofluorescence באמצעות נוגדנים שזיהו הורמון גדילה אנושי, או תג אפיטופ V5.

ניתוח כתמים מערביים אישר את הביטוי של Claudin-2 בחולדות שהומרו עם אדנווירוס, אך לא באלה שהותמרו עם וירוס מקודד GFP מבוקר. ניתוח אימונופלואורסנציה אישר עוד יותר ביטוי אקסוגני של Claudin-2 בתאי מטריה של דרכי השתן שהומרו עם Claudin-2 cDNA המקודד לנגיף. זיהוי של Claudin-2 אקסוגני בחלבון Tight Junction Protein 1 על ידי אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופ קונפוקלי של אורותל שלם רכוב או חתך חשף נוכחות של צומת הדוק והצטברות תוך תאית של Claudin-2 בציטופלסמה של התא.

שדה התמונה מראה כי ספירת מספר תאי המטריה המומרים מגלה יעילות המתקרבת ל -95% ובכל דופן שלפוחית השתן רק השתן מומרת, ואף רקמה אחרת אינה ממוקדת על ידי אדנווירוס המוחדר. הצנתור הוא קריטי כדי שהפרוטוקול יעבוד כמתוכנן. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור ביולוגיה תקינה של דרכי השתן, כמו גם להבין מצבים שבהם ביטוי יתר של חלבונים, או תת-ביטוי, מוביל למחלות.