Name: בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: למדו הדמיה של תאי תימוס בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית 2-פוטון בעכברים נאונטליים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בודדים ומאפיינת מנגנוני בחירה חיובית ושלילית של תאי T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מאט פול ג&#39;ימי וו לקבלת סיוע טכני.

המאמצת העברת הזרק בילודים עם 50-100ul של מח העצם באמצעות מזרק אינסולין 2-4 פעמים במהלך 3-7 הימים הראשונים לחייהם, עם יחס תורם ל-מארח הסופי של 01:01. מטרת אתר זריקה מתחת עצם החזה וכלוב הצלעות, אבל מעל המעיים והקיבה. הכנס את המחט רחוק מספיק כדי לחדור את הצפק, להיזהר לא לנקב את הסרעפת. אין זה נדיר עבור חלק במח העצם ללכת לאיבוד במהלך ההזרקה. ניתן להקטין את ההפסד על ידי התרופפות האחיזה שלך על הגור תוך כדי להזריק מנת לאפשר לעור להתרחב, ואז, לאט מוציא את המחט. Dissection של קורנית עושים חתך דרך קו האמצע לחתוך או לקרוע את העור ממנו כדי לחשוף את החזה. חכה עד עצם החזה וחתך דרך הצפק והסרעפת. חותכים את הצדדים של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה. בלוטת התימוס נמצאת בחלק העליון של הלב. לכן, כדי לשמר את המבנה של התימוס, לשמור על הרקמה הסובבת כפי שאתה לנתח את בלוטת התימוס. שוטפים את התימוס עם PBS לשמור אותו מהתייבשות במהלך הניתוח. בעדינות להקניט ממנו רקמה עודפת על פני השטח של הקפסולה הרתי ולחצות את שתי האונות. הכנת רקמות for Imaging השתמש דבק רקמות וטרינרי על הדבק התימוס שום coverslip ריבוע. השתמש pipetteman לשים שבריר microliter של דבק. מורחים את הדבק לאורך משוער והרוחב של התימוס. התימוס יציב נגד coverslip וגרור אותו למקומו. שני הפוטונים הדמיה רקמה היא שקוע DMEM ללא פנול אדום כי הוא perfused עם 95% חמצן ופחמן דו חמצני 5% והתלהב 37 ° C. עירור שני הפוטונים הושג באמצעות Spectra-Physics MaiTai לייזר מכוון 900nm, ו - CFP, ה-GFP, YFP וטקסס אור אדום פליטת הופרד באמצעות 495, 515, 560 מראות dichroic ואסף באמצעות גלאי PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הדמיה דו פוטון התימוס מאפשר לנו לבחון, איברים חיים שלמים אינטראקציות הגירות העומדים בבסיס האירועים מבחר בתוך התימוס.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

מיקרוסקופית שני הפוטונים (TPM) מאפשר לנו תמונה עמוק לתוך התימוס ולתעד את האירועים החשובים לפיתוח thymocyte. כדי לעקוב אחר המעבר של יחידים בתוך קהל של thymocytes, אנחנו מייצרים מפלצות בילוד שם פחות מאחוז אחד של thymocytes נגזרות תורם כי הוא מהונדס עבור חלבון פלואורסצנטי להביע בכל מקום בגוף. כדי להפיק אלה מפלצות hematopoetic חלקית, מקבלי בילוד מוזרקים עם מח עצם בין 3-7 ימים של גיל. לאחר 4-6 שבועות, העכבר הוא הקריב את התימוס הוא גזור בקפידה bissected שמירה על הארכיטקטורה של הרקמה יהיה הדמיה. התימוס הוא מודבק על coverslip כהכנה לשעבר vivo הדמיה על ידי TPM. במהלך הדמיה התימוס נשמר DMEM ללא פנול אדום כי הוא perfused עם 95% חמצן ופחמן דו חמצני 5% והתלהב 37 ° C. שימוש בגישה זו, אנו יכולים לחקור את האירועים הנדרשים עבור הדור של רפרטואר מגוון T התא.

אנו מציגים צעד אחר צעד הוראות עבור הדור של מפלצות הילוד וכן לנתיחה והכנת התימוס עבור vivo לשעבר הדמיה על ידי מיקרוסקופית 2-פוטון.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית (TPM) מאפשרת לנו לדמות תמונות בעומק הטימוס ולתעד אירועים החשובים להתפתחות התיימוציטים. כדי לעקוב אחר ה...

דימוי דו-פוטוני שימושי עבור תחום האימונולוגיה מכיוון שהוא מאפשר לנו לעקוב אחר נדידתה של תא בודד בעת מפגשו עם סביבתו. באמצעות מעקב אחר נדידה באתר התימוס, ושימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית, אנו יכולים לאפיין את המנגנון של ברירה חיובית ושלילית.שלום, אני אינה לוטי מהמעבדה של ד"ר אלן רובי באוניברסיטת קליפורניה בברקלי. ואני פול הרצמרק, גם אני מהמעבדה של אלן רובי. היום נראה לכם כיצד אנו מבצעים דימות in situ של רקמת תימוס, ואני אראה לכם כיצד ניתן להשתמש במיקרוסקופ הדו-פוטוני שלנו כדי לדמות את התימוס.אראה לכם את השלבים המקדימים לדימוי דו-פוטוני. אלו כוללים את הפרוצדורות הבאות: בידוד תאי גזע המטופואטיים ממוח העצם, העברה אדופטיבית של תאי מוח עצם לרכבנים, נתיחה וחצייה של התימוס, והכנת הרקמה לדימוי באמצעות מיקרוסקופיה סורקת בלייזר דו-פוטוני. אז בואו נתחיל.לפני שנוכל להכין את התימוס לדמיון, עלינו לבצע תחילה העברה אדופטיבית של תאי מחית עצם לעכבר ניאונטלי. תאי מחית עצם אלה בודדו מהרגליים האחוריות של עכברים טרנסגניים המבטאים GFP באופן אוניברסלי. זוהי מזרק אינסולין עם 50 µL של מחית עצם.אנו מבצעים שתיים עד ארבע הזרקות למארחים בני שלושה עד שבעה ימים, תוך שימוש במח עצם מתורם אחד עבור כל גור שמוזרק. כאן יש לנו גור בן חמישה ימים; צבטו את העור לאחור כדי למנוע מהגור לזוז במהלך ההזרקה ולהחזיק את העור מתוח. כוונו לאתר הזרקה שנמצא מתחת לריאות ולכלוב הצלעות, אך מעל למעיים ולקיבה.בזמן ההזרקה, הרפו את האחיזה בעור כדי לאפשר לו להתרחב. לבסוף, הוציאו את המזרק באיטיות כדי להגביל את כמות מחול השתבץ שאובדת. עכברים אלו יתפתחו במשך ארבעה עד שישה שבועות, ולאחר מכן ניתן יהיה להוציא את התימוס לצורך דימות.לאחר ארבעה עד שישה שבועות, ניתן להסיר את הבלוטה התיםוס (thymus). לצורך ההדמיה, אשתמש בסט של פינצטות ומספריים גדולים וכן בסט של פינצטות ומספריים קטנים. עכבר זה נשחט בהתאם לפרוטוקול השימוש בבעלי חיים שלנו ורוסס באתנול.אשתמש בפינצטה הגדולה כדי לתפוס את העור ולבצע חתך בקו האמצע. כעת אני יכול להשתמש במספריים כדי לחתוך לאורך קו האמצע, או לקרוע את העור מהפריטונאום, ואני אקבע את העור בעזרת סיכות כדי לחשוף את חלל החזה. אהחזיק בעצם החזה בזמן שאחתוך דרך הפריטונאום ואחדור לחלל החזה דרך הסרעפת, ולאחר מכן אבצע חיתוך לאורך דפנות כלוב הצלעות.ניתן לראות את התימוס המונח ממש מעל הלב. אני מחזירה אותם למקומם. כך נראה התימוס.אני אמנע מלהיגע בזה. אתה תשתמש בפינצטה הקטנה יותר, ותמשיך להחזיק את הרקמה מסביב לתימוס. אוקיי, עכשיו אני הולך לרסס את האזור ב-PBS ולהתחיל להסיר חלק מהרקמה העודפת.לכן אשתמש ברקמה שסביב התימוס כדי להחזיק אותו. בזמן שניקיתי את התימוס, אסימי את הרקמה העודפת על ידי גזירה זהירה. כעת ישנם שני אונויות בתימוס שעלינו להפריד ביניהן במהלך הניקיון.אך ראשית, אני אסיר את כל כלי הדם העודפים הנמצאים על פני התימוס. אני נזהר מאוד לא להפריע למבנה התימוס אותו נדמיין. לכן, אני מסיר רק רקמה שנמצאת ממש על פני השטח.כעת אתחיל להפריד בעדינות את שתי האונות. אלו הן האונה הוונטרלית והאונה הדורסלית שאותן נפריד, תוך כדי חיתוך עדין של הרקמה והפרדתן זו מזו. איננו רוצים שהרקמה תתייבש, לכן נתיז עליה מעט PBS.כעת הפרדתי בין שתי האונות. זוהי האונה הגבית (dorsal lobe), שיש לה צורה אופיינית של גיטרה. וזוהי האונה הבטנית (ventral lobe) כאן.אני אהסיר את שאריות הרקמה מכל אחת מהאונות הללו כדי שאזור הדימות יהיה נקי מרקמה עודפת. עם זאת, אשאיר כמות קטנה של רקמה כדי שנוכל להחזיק בה את האונה. בעת הדימות, אנו נדמיין דרך הרקמה העודפת הזו, דבר שאינו נחוץ, והסרתה תשפר את איכות התמונה שלנו.כעת יש לנו את שני האונות החצויות שמוכנות להצמדה לזכוכית כיסוי לצורך דימוי. כדי להכין את התימוס החצוי לדימוי, תזדקקו לדבק לרקמות וטרינריות ולזכוכיות כיסוי בגודל 18 על 18. אני נוהג להשתמש בפיפטמן כדי להניח שבריר של מיקרוליטר של דבק על זכוכית הכיסוי.אני אשים טיפה של דבק באורך של התימוס שאותו נדמיין. לאחר מכן אני מעדיף להפיץ אותה. אם זהו רוחב התימוס, שוב, אני אשים את שני האונות על אותה זכוכית כיסוי.כעת אני ממקם אחד נוסף ממש כאן. אני אקח את האונה מהרקמה העודפת, אניח אותה על לוכית המכסה ואז אגרור אותה לאזור שבו נמצא הדבק. אני אעשה את אותו הדבר עבור האונה השנייה; שוב, אגע בלוכית המכסה באזור שבו אין דבק כדי לייצב את ידי, ואז אניח את האונה הטימוסית השנייה על לוכית המכסה.כעת, לאחר שהצמדנו את שני גlobi thymus לכיסוי הזכוכית, נעביר אותו לפול לצורך דימיון. תודה לך, אינה. ניקח את הדגימה הזו ונניח אותה במצע ה-DME שבו נשתמש לצורך הדימיון.זהו מערך מיקרוסקופ הפוטונים הכפולים שלנו. מיקרוסקופיה של פוטונים כפולים יעילה מאוד לדימיון תאי מערכת החיסון, מכיוון שניתן להביט עמוק אל תוך התימוס ולראות את התאים הפלואורסצנטיים נעים. השיטה משתמשת בלייזר אינפרה-אדום בפולסים כדי לגרום לתאים להפיק פלואורסצנציה.במיקרוסקופ המגנט שלנו ישנן ארבע מצלמות שונות המאפשרות לנו להמחיש בו-זמנית ארבעה צבעים שונים, והוא משתמש בעדשה אובייקטיבית מיוחדת, בעלת הגדלה של 20x. זוהי עדשה מיוחדת הטובלת בתוך מצע ה-DMEM שבו טבלנו את התימוס, מה שמאפשר לה להגיע ל-0.95 na, ערך גבוה מאוד שיהפוך את התאים שלנו לבהירים מאוד. כדי לשמור על הרקמה בריאה, אנו מבעבעים 95% oxygen ו-5% CO2 דרך מצע ה-DMEM.משם, הנוזל נשאב אל תא הפרפוזיה שם הוא מחומם ל-37 מעלות, ושם טבולות הטימוס נמצאות. באמצעות מערכת זו, אנו יכולים לשמור על התאים בטימוס בריאים למשך ארבע שעות של דימוי. כך הצגתי בפניכם כיצד להגדיר את הדימוי עבור מיקרוסקופ הפוטונים הכפול.כעת נבחן חלק מהתוצאות שלנו בסרטון הלולאתי זה. ניתן לראות כאן את התימוס שדימיינו בארבעה צבעים שונים. הצבע האדום מייצג כלי דם מהתימוס, והצבע הצהוב מייצג תאי דנדריטיים מהמארח, המבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב תחת בקרתו של מקדם (promoter) ספציפי לתאים דנדריטיים.התימוציטים הכחולים והירוקים שאתם רואים כאן הם משני תורמים שונים שבהם השתמשנו כדי ליצור כימרה ניאונטלית באמצעות טכניקת העברה אדופטיבית ש-Ena הראתה לכם קודם לכן. התאים הירוקים הם תימוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק, והתאים הכחולים הם תימוציטים מהתורם שבטא חלבון פלואורסצנטי ציאני. זהו אותו סרטון בלולאה שהראיתי לכם קודם, אך אני רוצה להראות לכם את התלת-ממדיות של מערכי הנתונים שאספנו כדי להפיק את הסרטונים הללו.אנו מתמקדים במישור מסוים ומצלמים תמונה, לאחר מכן מתמקדים מעט עמוק יותר ומצלמים תמונה נוספת, וכך הלאה לעומק נוסף בתמונה נוספת. עבור סרטון זה, ירדנו לעומק של כ-60 microns, ולאחר מכן חזרנו על נפח תמונות זה בערך בכל 30 seconds כדי לקבל את הנפח הנע. סרטון זה צולם לאורך כ-20 דקות.כך נוכל לעקוב אחר התאים בשלושה ממדים לאורך זמן. הרגע הצגנו בפניכם כיצד אנו מדמיינים את הטימוס באמצעות מיקרוסקופיית פוטון דו-פוטוני. ההיבטים החשובים ביותר של הליך זה הם, ראשית, הזרקת מח עצם מתורמים ל新生נאטים.שנית, נבצע דיסקציה של הטימוס מבלי לפגוע במבנהו. שלישית, נצמיד את הטימוס בחוזקה לזכוכית כיסוי לצורך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הדמיה של הטימוס יכולה לספק תשובות לשאלות רבות בנוגע להתפתחות התיםוציטים ויצירת רפרטואר מגוון של תאי T.זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.

Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.

טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

מחקר זה מציג גישת הדמיה דו-פוטונית ב-in vivo להמחשת המבנים של טרמינלי אקסון בעלי סף נמוך (LTMR) בעור כף הרגל הקדמית של עכברים. באמצעות דימות חוזר ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים, שיטה זו מספקת פלטפורמה חדשה לחקר מבנה ותפקוד המעגל החישי העור במהלך ההתפתחות ובמבוגרים.

הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של מורפולוגיית אקסון חושי במגע בעור עכבר

למדו הדמיה של תאי תימוס בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית 2-פוטון בעכברים נאונטליים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בודדים ומאפיינת מנגנוני בחירה חיובית ושלילית של תאי T.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים