Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation
21 ביולי 2023
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.
המחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בהתוויית המנגנונים המווסתים את הפיזיולוגיה של תאי האנדותל. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל כלייתיים, במיוחד מנימי לימפה תרמיים במתקנים שבהם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין. הפרוטוקול מאפשר בידוד של תאי אנדותל לימפטיים מעכברים טרנסגניים כדי לחקור את הפיזיולוגיה שלהם במבחנה.
זה מתאים במיוחד כאשר הטוהר של תאי אנדותל הלימפה יכול להיפגע עבור יישומים במורד הזרם. תהליך זה מספק תפוקה גבוהה של תאי אנדותל לימפטיים המתקבלים מנימי הלימפה ולא מכלי איסוף אחרים. זוהי גם חלופה נחמדה במקרה של היעדר מתקני מיון תאים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד של תאי אנדותל לימפטיים מעור של עכבר באמצעות חרוזי מגנט, אשר ניתן להשתמש בו למחקרים פיזיולוגיים in vitro. השיטה מועילה במיוחד במצבים שבהם מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) אינו זמין, ומאפשרת בידוד של תאים אלה בנשוא גבוה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- פיזיולוגיה של תאי אנדותל
- טכניקות לבידוד תאים
- ניסויים in vitro
רקע
- חשיבותן של תאי אנדותלליים לימפטיים במחקר ביולוגי
- אתגרים בבידוד אוכלוסיות תאים טהורות
- יישומים בחקר תפקודי תאי אנדותל
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד מבוסס חרוזי מגנט
- מערכת מודל עכברית
- טכניקות לתרבית תאים והכנת מצעים
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי אנדותלים לימפטיים בדרגת טהרה גבוהה
- אישור נוכחותם של תאים חיוביים ל-LYVE1 לאחר הבידוד
- תרבית in vitro המדגימה יכולת הסתגלות למחקרים המשכיים
מסקנות
- השיטה משפרת ביעילות את בידוד תאי אנדותל לימפטיים של עכברים עבור מחקרים פיזיולוגיים.
- פרוטוקול זה מציע לחוקרים חלופה ישימה לטכניקות מיון מסורתיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
בידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים עוריים של עכברים (DLECs) מאפשר מחקרים מכניסטיים של התפקוד הלימפטי ותפקידים ספציפיים של גנים במערכות רלוונטיות למחלה. פרוטוקול זה תומך בתיקוף מטרות ובבדיקת מסלולים בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד כאשר אין תשתית מתקדמת למיון תאים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי למחקר תרגומי ולסינון תיקי פיתוח בביולוגיה לימפטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח תפקודי של השפעות ספציפיות לגנים בתאי אנדותל לימפטיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות בידוד של DLECs טהורים למחקרים מכניסטיים.
- מקל על הבהרת מסלולים באמצעות מודלים טרנסגניים וטכנולוגיית Cre-lox.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות במחקר לימפטי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק אוכלוסיות תאים ראשוניות מאושרות לבדיקות in vitro המשך.
- מקיים סטנדרטיזציה של בידוד התאים לצורך תוצאות ניסיוניות כמותיות וניתנות לשחזור.
- מאפשר פיתוח בדיקות במתקנים שאין בהם מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- תומך בהערכה מהימנה של ביטוי גנים ותפקוד חלבונים ב-DLECs.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלות לצורך חקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של מערכת הלימפה.
- שומר על רצף מהשלב של מניפולציה גנטית ועד לאישור תפקודי במסגרות פרה-קליניות.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי מתן אפשרות למחקרים מנגנוניים ex vivo ו-in vitro.
שילוב תהליכי עבודה וסדר פעולות
שיטת בידוד זו, המבוססת על חרוזי מגנט, מתאימה לרצף השלב שבין הגילוי המוקדם לשלב הפרה-קליני, ותומכת הן במחקר מונחה-השערה והן בתיקוף תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מסייע בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים מכניסטיים במערכות אנדותליאליות לימפטיות.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מוכנות למשחקים (assays) ותהליכי עבודה המשכיים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של רמות ביטוי של גנים וחלבונים ב-DLECs מבודדים.
- מחקר תרגומי: מספק גשר בין מניפולציה גנטית להערכה תפקודית במודלים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה, הניתן להתאמה במודלים של עכברים ובצוותי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזואי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים של מערכת הלימפה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד תאים לצורך הדירות ויכולת הרחבה במחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לתיקוף יעדים (target validation) חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות הקשורות למערכת הלימפה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיחה של עכברים ובטכניקות של תרבית תאים ראשוניים.
- נדרשת גישה לטיהור באמצעות חרוזי מגנט ולתשתית דימיון בסיסית.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות בניתוח ביטוי גנים.
- ניתן להשקל למודלים שונים של עכברים טרנסגניים המשתמשים בקידודים (promoters) ספציפיים למערכת הלימפה.
- מוגבל עקב היעדרה של מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) במתקנים מסוימים.
