הכנת איים עובריים פרימטים קפואים שאינם אנושיים לריצוף RNA משולב של גרעינים בודדים וריצוף ATAC, ומטבולומיקה בתפזורת
8 בנובמבר 2024
פרוטוקול זה מתאר הליכים לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מאיי לבלב פרימטים קפואים שאינם אנושיים לשימוש בריצוף RNA סימולטני של גרעין יחיד וריצוף ATAC תוך שמירה על החלק הציטוסולי בתפזורת לניתוחים מטבוליים מאותן דגימות.
אנו משתמשים במודל פרימטים לא אנושי כדי להעריך כיצד תזונה אימהית וצריכת תרופות במהלך ההריון משפיעות על ההתפתחות העוברית והתפקוד לאחר הלידה של איי הלבלב בצאצאים. שינויים מתוכנתים התפתחותית יכולים לשנות את הרגישות למחלות בשלב מאוחר יותר בחיים. אתגר בעבודה עם דגימות קשות להשגה, כגון אלה של פרימטים לא אנושיים, הוא להעריך שאלות מרובות מאותו אדם ביעילות.
למרבה הצער, חילוץ בו זמנית של מידע מהמטבוליזם ומהגנום יכול להיות קשה בגלל חוסר התאימות של ריאגנטים לבדיקה בפירוק רגיש בזמן של מולקולות שיש לכמת. הפרוטוקול שלנו מאפשר אקסטרפולציה של שפע מטבוליטים, נגישות כרומטין וביטוי גנים דיפרנציאלי מאותו חומר מוצא. גישה רב-שכבתית זו מספקת תובנה כיצד חילוף החומרים עשוי לשנות את הגנום באיי הלבלב.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מאיים לבלב של פרימטים שאינם אדם שהוקפאו, לצורך ביצוע רצף RNA ורצף ATAC בו-זמנית. הפרוטוקול משמר גם את פלקציית הציטוזול הכוללת לצורך אנליזות מטבולומיות, ובכך מאפשר הבנה מקיפה של אינטראקציות מטבוליות וגנומיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מטבולינומיקה
רקע
- מודלים של פרימטים שאינם בני אדם הם חיוניים לחקר מנגנוני מחלות אנושיות.
- תזונה ותרופות של האם עשויות להשפיע על התפתחות אירי הלבלב של הצאצאים.
- ניתוח סימולטני של המטבוליזום והגנום הוא מאתגר בשל התפרקות הדגימות.
- מחקר זה נותן מענה לצורך בניתוחים רב-שכבתיים יעילים מדגימות מוגבלות.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של גורמים אימהיים על התפתחות איים הלבלב העובריים.
- לבחינת האופן שבו שינויים מטבוליים יכולים להשפיע על ביטוי גנומי.
- לפיתוח פרוטוקול המאפשר ניתוח מקיף מאותה דגימה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד גרעינים מאיים לבלביים.
- ריצוף RNA וריצוף ATAC בו-זמנית.
- שימור פראקציות ציטוזוליות למחקרי מטבוליקה.
- ניתוח רב-שכבתי להערכת שפע מטבוליטים וביטוי גנים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של גרעינים ושל פראקציות ציטוזול באיכות גבוהה.
- תובנות לגבי האופן שבו תזונת האם משפיעה על תפקוד איים לבלביים.
- הוכחת היתכנות לביצוע ניתוחים גנומיים ומטבוליים בו-זמנית.
- חשיפת קשרים פוטנציאליים בין מטבוליזם לביטוי גנים באיים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מקיף של אי islets הלבלב.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על רגישות למחלות.
- מדגיש את חשיבותן של השפעות האימהות על בריאות הצאצאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
שילוב של RNA-seq של גרעין בודד, ATAC-seq ומטבולומיקה מאסיבית (bulk metabolomics) מאיים של פרימטים שאינם אנושיים שהוקפאו, פותר צוואר בקבוק קריטי בגילוי מולטי-אומי באמצעות דגימות נדירות או יקרות. גישה זו מאפשרת פרופיל מולקולרי מקיף מחומר מוגבל, ובכך תומכת בוודאות ניבוי בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים. הפרוטוקול ממקסם את תפוקת הנתונים מדגימה בודדת, ובכך מספק בסיס לקבלת החלטות בתיקי מחקר המותאמות לסיכונים במחקר של מחלות מטבוליות והתפתחותיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנונים מטבוליים ואפיגנטיים העומדים בבסיס הזהות התאית במערכות רלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור בין שפע של מטבוליטים לבין ביטוי גנים ונגישות של כרומטין.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי שילוב של נתונים מולקולריים רב-שכבתיים מאותו מקור ביולוגי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין גרזנוקי גרעינים ופרקציות ציטוזוליות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של רצף עדיף (high-throughput sequencing) ומטבולומיקה בהמשך.
- משפר את הדירות והסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מזעור אפקטי אצווה במחקרים רב-קוהורטיים.
- מאפשר פלטיים קוונטיביים מולטי-אומיים להערכה חסונה של תרכובות או הפרעות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם קריאות מולקולריות עם סמנים מטבוליים ואפיגנטיים רלוונטיים למחלה במודלים תרגומיים.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימוש במערכות של פרימטים שאינם בני אדם.
- מספק תובנות חיזויות לגבי תכנות התפתחותי ומנגנוני רגישות למחלות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף המטרה ומחקר תרגומי, על ידי התמראה של פרופילי מולטי-אומיקה מדגימות רקמה נדירות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על אינטראקציות מטבוליות-אפיגנטיות במהלך התפתחות האיים.
- סריקה: מספק תכונות גרעין ומטבוליטים הניתנות לשחזור עבור בדיקות אומיקה בהיקף רחב.
- אנליטיקה: מספק נתונים כמותיים של ביטוי גנים, נגישות כרומטין ושפע מטבוליטים לצורך ניתוחים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים לפנוטיפים רלוונטיים למחלה במודלים של פרימטים שאינם אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר למקסום חילוץ נתונים מדגימות מוגבלות או מאושרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבים מוקדמים של המחקר.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת דגימות מולטי-אומיות (multi-omic) ומזכור השפעות אצווה (batch effects).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת ניסויים (go/no-go) ושימוש יעיל במשאבים עבור דגימות נדירות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של תוכניות מחקר למחלות מטבוליות והתפתחותיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד גרעינים, ריצוף גרעינים בודדים ותהליכי עבודה של מטבוליזומיקה.
- מחייב גישה לתשתיות של ריצוף בספיקה גבוהה וספקטרומטריית מסות.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי לשלוט באפקט המגבשים (batch effects).
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות אחרים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור מטריצות דגימה שונות.
- מחסור בדגימות ורגישות לפירוק מטילים מגבלות מעשיות על הספיקה והתזמון.
