הדמיה לא פולשנית של מורפולוגיה מיקרו-וסקולרית ממוסמרת בעכברים באמצעות קפילרוסקופיה
28 בפברואר 2025
קפילרוסקופיה היא כלי נגיש להדמיה ישירה, זולה ולא פולשנית של מיקרו-כלי דם. מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים להשתמש בקפילרוסקופיה להדמיה של מורפולוגיה מיקרו-וסקולרית היקפית בציפורניים של עכברים.
אחד מתחומי העניין של המעבדה שלנו הוא תפקוד לקוי של כלי הדם במחלות ניווניות. אנו שואפים לאתר ולנטר פתולוגיה מיקרו-וסקולרית היקפית באמצעות קפילרוסקופיה כדי לקבל תובנה לגבי תפקידה הפוטנציאלי במחלות מערכת העצבים המרכזית. איתור תפקוד לקוי של כלי הדם בבעלי חיים הוא לרוב פולשני, מבוצע ex vivo או יקר. בעזרת פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להעריך בקלות ובזול את המיקרו-כלי דם הממוסמרים ולתרגם את ממצאי הקפילרוסקופיה הקלינית של הציפורניים למודלים של בעלי חיים. אנו מציגים מיקום חדש להמחשת שיקוף מיקרו-כלי דם היקפיים, הציפורן. בהשוואה לקפילרוסקופיה של קפלי ציפורניים, קפילרוסקופיה ממוסמרת מספקת שטח גדול יותר להתבוננות טובה יותר במורפולוגיה ובמבנה המיקרו-וסקולרי.
[מדריך] כדי להתחיל, מקם את העכבר המורדם על שולחן הניתוחים לצורך ההליך. לאחר מכן מרחו ג'ל עיניים סיכה או משחת עיניים סטרילית שאינה תרופתית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. לאחר מכן, תוך שמירה על בעל החיים תחת הרדמה באמצעות חרוט אף, מרחו כמות נדיבה של קרם להסרת שיער על כל הכפה באמצעות מוליך. הקפידו על כיסוי מלא של אזורי הכפות והציפורניים. לאחר שהשארתם את הקרם למשך שתי דקות, נקו בזהירות את הקרם להסרת שיער עם טישו נקי, ושטפו את הכפה במים סטריליים פושרים. 24 שעות לאחר הסרת הפרווה, הגדר את ציוד הקפילרוסקופיה בחדר מבוקר טמפרטורה הנשמר בין 21.5 ל-22.5 מעלות צלזיוס. חבר את הקפילרוסקופ למחשב נייד באמצעות חיבור USB. פתח את יישום תוכנת הווידיאו הראשון במחשב הנייד. לאחר הרדמה נכונה של העכבר, יש למרוח ג'ל עיניים חומר סיכה או משחת עיניים סטרילית שאינה תרופתית על שתי העיניים. הנח סרט מעבדה לבן או חומר רקע דומה מתחת לכפה כדי לשפר את הניגודיות ולשפר את הדמיית הכלי. כעת מקם את כף הרגל האחורית כלפי מעלה על פלטפורמת קלטת המעבדה, מתחת למטרה. פרשו בעדינות את אצבעות הרגליים כדי להפריד את הציפורניים מתחת למטרת המיקרוסקופ באמצעות אפליקטור. ודא שהציפורניים מופרדות בבירור להדמיה אופטימלית של כלי הדם. דמיין מה מוגדל על ידי הקפילרוסקופ והתמקד במסמר על ידי כוונון מכווני שלב X ו-Y וגלגל ההגדלה כדי לקבל תמונה ברורה. כדי להפחית סנוור ולשפר את הריכוז, יש למרוח בנדיבות שמן טבילה על הכף, כדי להבטיח כיסוי מלא של הציפורניים. התמקדו בציפורן של הספרה השנייה של הכף האחורית, מכיוון שזהו הציפורן הגדולה ביותר, והכי קל לצלם בעכברים. כוונן את כוונוני ה-X וה-Y ואת גלגל ההגדלה כדי להביא את רשת כלי השיט למיקוד. התאם את המטרה כדי למזער סנוור ולהביא את רשת כלי הציפורניים לתצוגה. כדי להקליט סרטון, לחץ על כפתור ההקלטה האדום בבכורה. שמור כל סרטון בתיקיית הפרויקט המתאימה, ותייג כל סרטון בהתאם. לאחר מכן, פתח את תוכנת ImageJ וגרור את הקובץ לממשק התוכנה כדי לטעון את התמונה. כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות, בחר תמונה, ולאחר מכן כוונון ובהירות/ניגודיות. כלי זה עוזר לשנות את הניגודיות של התמונות כדי לדמיין טוב יותר את המורפולוגיה של כלי הדם. לאחר התאמת התמונה, לחץ על קבע בכלי בהירות/ניגודיות. לבסוף, עבור אל קובץ, שמור בשם ובחר Tiff כדי לשמור את התמונה. מורפולוגיה של כלי דם ממוסמרים צולמה בהצלחה בשיטת הקפילרוסקופיה. כלי דם ממוסמרים טיפוסיים של עכבר היו מורכבים מכלי אפרנטי, כלי נשפך ורשת של נימים המחברים בין שניהם. רשת הנימים הממוסמרת הייתה עקבית על פני זני עכברים שונים, כפי שהודגם בעכברים מסוג בר על רקע SV129/S6 ורקע C57/B6J.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול חדש לקפילרוסקופיה, המאפשר לחוקרים לדמות את המורפולוגיה של המיקרווסקולריות הפריפריאלית במיטות הציפורניים של עכברים. שיטה לא פולשנית זו מאפשרת להעריך תפקוד לקוי של המיקרווסקולריות, במיוחד בהקשר של מחלות ניו روندגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- פתולוגיה מיקרו-וסקולרית
- מחלות ניווניות של מערכת העצבים
- טכניקות קפילרוסקופיה
רקע
- חשיבות חקירת תפקוד כלי דם לקוי במודלים של בעלי חיים
- אתגרים בשימוש בטכניקות פולשניות או יקרות הקיימות כיום
- הצגת קפילרוסקופיה של מיטת הציפורן כשיטת תצפית משופרת
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הליך קפילרוסקופיה להדמיית כלי דם במיטת הציפורן
- מודלים של עכברים, ובייחוד שימוש בזני פרא (wild-type)
- תוכנת הדמיה מתקדמת ללכידה וניתוח של תמונות
תוצאות עיקריות
- דימות יעיל של כלי הדם במיטת הציפורן
- רשת קפילריות עקבית במיטת הציפורן בין זני עכברים שונים
- יישום מוצלח של יכולות הקפילרוסקופיה להערכת מורפולוגיה מיקרו-וסקולרית
מסקנות
- מדגים גישה אמינה וחדשנית לחקר מורפולוגיה של מיקרו-כלי דם
- השלכות משמעותיות למחקר על תפקוד לקוי של כלי דם הקשור למצבים נוירולוגיים
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
קפילרוסקופיה לא פולשנית של מיטת הציפורן בעכברים מאפשרת ויזואליזציה מהירה וכלכלית של מורפולוגיה מיקרו-וסקולרית פריפרית, ובכך היא נותנת מענה לפער תרגומי קריטי בין מחקר וסקולרי קליני לפרה-קליני. גישה זו תומכת בזיהוי מוקדם ובניטור של תפקוד לקוי של כלי דם זעירים במודלים של מחלות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי לגילוי תרופות המכוונות לכלי דם. יכולת השחזור וההתרחבות שלה ממיגדות אותה כנכס בעל ערך להסרת סיכונים מכניסטיים (de-risking) ותיקוף מטרות ברוחב הפורטפוליו בהפרעות מערכתיות ונוירו-וסקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של ארכיטקטורת המיקרו-כלי דם לצורך תיקוף של יעדים פונקציונליים במודלים של מחלות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות אספקת ראיות מורפולוגיות למעורבות של כלי דם במצבים מערכתיים ובמחלות נוירודגנרטיביות.
- מסייע בבדיקה מונחית-השערה של שינויים במיקרו-סירקולציה הקשורים להתערבות טיפולית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת פלטפורמת דימוג סטנדרטית וניתנת לשחזור לצורך כימות שינויים במיקרו-כלי דם בין זני עכברים שונים.
- מספקת פלטים כמותיים בעלי ניגודיות גבוהה, המתאימים לניתוח תמונות המשך ולפיתוח בדיקות (assays).
- מאפשרת סריקה בקנה מידה רחב של תרכובות המשפיעות על מיקרו-כלי דם פריפריאליים תוך מזעור מצוק בעלי חיים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מסנכרן מדדי מיקרו-כלי דם פרה-קליניים עם נקודות קצה של קפילרוסקופיה קלינית, ובכך משפר את הרצף התרגומי.
- תומך בקבלת החלטאות לגבי קידום מותאם סיכון על ידי אפשור ניטור לרוחב לא פולשני של פתולוגיה וסקולרית.
- מסייע בגילוי ביומרקרים עבור מודלים של מחלות סיסטמיות ונוירו-וסקולריות שבהן מעורבת המיקרו-סירקולציה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול קפילרוסקופיה זה משתלב ברצף שבין הגילוי למשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי בביולוגיה של כלי הדם.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת ראיות ישירות, in vivo, למעורבות של מיקרו-כלי דם במכניזמי מחלה.
- סריקה: מציעה תוצרי דימות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות ותקינה של בדיקות.
- אנליזה: מאפשרת מדידה אובייקטיבית של מורפולוגיית כלי דם ושל שלמות הרשת באמצעות ניתוח דיגיטלי של תמונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במודלים של בעלי חיים לנקודות קצה קליניות של מיקרו-כלי דם, ובכך תומך בהתאמת סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימות לא פולשנית בעלת יישום רחב למודלים מגוונים של מחלות ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר המכוון לכלי דם.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה של דימות סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וכלכליות לצורך השוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אפשור הערכה מוקדמת ולא פולשנית של נקודות סיום וסקולריות.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות המכוונות לתפקוד לקוי של מיקרו-כלי דם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בבעלי חיים קטנים ובניתוח תמונות דיגיטליות.
- נדרש ציוד סטנדרטי לבדיקת קפילרוסקופיה ותוכנת דימות תואמת (למשל, ImageJ).
- נדרש תיאום בין צוותים בנוגע לפרוטוקולי דימות ולסטנדרטים של פרשנות נתונים.
- ניתן להתאמה למספר זני עכברים ומודלי מחלה הכוללים מעורבות של כלי דם פריפריאליים.
- מוגבל להערכה מורפולוגית; נקודות קצה פונקציונליות או מולקולריות דורשות בדיקות משלימות.
