הפרדה ואפיון דיפרנציאלי של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי מעיים בחולדות רגישות למלח בתנאי תזונה עתירי מלח

מחקר זה בוחן את תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי המעיים בחולדות עם יתר לחץ דם רגיש למלח בתזונה עתירת מלח, ובוחן כיצד תזונה עתירת מלח משנה את השלפוחיות ומשפיעה על אינטראקציות יתר לחץ דם ואינטראקציות חיסוניות. ההתקדמות האחרונה בתחום זה כוללת הבנת תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי המעיים ביתר לחץ דם, הערכת ההשפעה של תזונה עתירת מלח על מגוון חיידקים ויישום התערבויות מבוססות צמחים המכוונות לשלפוחיות מוויסות מטבולי וחיסוני. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות בעדיפות גבוהה, הבחנה בין שלפוחיות נגזרות לשלפוחיות מיקרוביום, מזעור אובדן דגימה בפרוטוקולי הצביעה הסטנדרטיים כדי להבטיח שחזור בין מחקרים. רשת צפיפות זו ופרוטוקול צנטריפוגה מספקים עדיפות גבוהה יותר לשלפוחיות חוץ-תאיות עם שלמות ושחזור משופרים בהשוואה לשיטות מסורתיות, מה שמאפשר מחקר שלפוחית חוץ-תאי אמין יותר של מיקרוביום המעי במחקרי יתר לחץ דם.

[קריין] כדי להתחיל, העבירו חמישה גרם צואה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר שנשקל מראש. הוסף לצינור 50 מיליליטר PBS נטול אנדוטוקסין שחומם מראש 37 מעלות צלזיוס וסובב את הצינור למשך 30 דקות. מצננים את הצנטריפוגה המהירה ל -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו את הדגימה בצורה סימטרית בצנטריפוגה וסובבו ב-8,000G למשך 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש. לאחר צנטריפוגה שוב למשך 15 דקות, שאפו את הסופרנטנט בזהירות והשתמשו בו להמשך ניתוח. הניחו יחידת פילטר סטרילית של 0.22 מיקרומטר על קרח. העבירו את ה-supernatant לחלק העליון של המסנן והפעילו את משאבת הוואקום כדי לאסוף את הדגימות המסוננות. העבירו את המסנן למסנן צנטריפוגלי עם חתך של 10 קילודלטון וקיבולת של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס 3000 גרם למשך 30 דקות כדי לרכז את הדגימה ל-1,400 מיקרוליטר לפחות. הניחו מיד את הדגימה על קרח. מערבבים נפח אחד של מאגר שיפוע A עם חמישה נפחים של מדיום שיפוע צפיפות כדי להכין את פתרון העבודה. הכן תמיסת יודיקסנול של 10% על ידי ערבוב יחידה אחת של תמיסת עבודה עם ארבע יחידות חיץ B. באופן דומה, ערבבו שתי יחידות של תמיסת עבודה עם שלוש יחידות של בופר B לתמיסת יודיקסנול של 20% וארבע יחידות של תמיסת עבודה עם יחידה אחת של בופר B לתמיסת יודיקסנול של 40%. כעת מערבבים את הדגימה המרוכזת שהוכנה קודם לכן עם שבעה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות כדי ליצור תמיסת יודיקסנול של 50%. להכנת שיפוע צפיפות, הוסף תמיסת טריפאן כחולה לתמיסות 40% ו-10% יודיקסנול. העבירו שמונה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול 50% לתחתית צינור צנטריפוגה מפוליפרופילן בעל דופן דקה. הטה את הצינור ל-70 מעלות והעביר שמונה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול 40% למשטח הנוזל. לאחר מכן, הוסף שמונה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול 20%, ואחריהם שבעה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול 10% ושני מיליליטר PBS ללא אנדוטוקסין. קח את צינור שיפוע הצפיפות המוכן והנח אותו לתוך אולטרה-צנטריפוגה מקוררת מראש. הגדר את פרמטרי האולטרה-צנטריפוגה ל-100,000G 20 שעות ו-10 מעלות צלזיוס והתחל את הריצה. להפרדת צפיפות שיפוע ידנית לאוסף, שיפוע הצפיפות הוא כ -34 מיליליטר נוזל. שני מיליליטר תמיסה מופקים לאט ממרכז המשטח הנוזלי, וכל תמיסה של שני מיליליטר היא שיפוע. אז פתרון שיפוע הצפיפות מחולק ל -17 שיפועים. לבסוף, בעזרת פיפטה, העבירו את שברי הצפיפות לצינורות דגימה סטריליים והניחו אותם מיד על קרח. ניתוח מעקב אחר חלקיקי ננו חשף את פרופילי הגודל, ההתפלגות והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות שנאספו משברי שיפוע צפיפות שונים. רוב השלפוחיות החוץ-תאיות בכל השברים התרכזו בטווח הגודל של 30 עד 100 ננומטר בהתאם לדפוס התפלגות אופייני. ריכוז השלפוחיות החוץ-תאיות הגיע לרמתו הגבוהה ביותר בשבר תשע, והגיע לשיא של כ-3.85 כפול 10 בחזקת תשעה חלקיקים למיליליטר. תכולת החלבון, שנמדדה באמצעות ערכת חומצה ביצינצ'ונינית, הייתה גם היא הגבוהה ביותר בשבריר תשע עם 0.417 מיקרוגרם למיקרוליטר. בנוסף, רמות הביטוי של ליפופוליסכרידים, שנקבעו באמצעות ערכת זיהוי אנדוטוקסין, היו גבוהות משמעותית בשברים 9 ו-10. כמויות גדולות יותר של חלבון נצפו גם בשבריר תשע במהלך ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט פולי אקרילאמיד. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, או תמונות TEM, חשף את השלפוחיות החוץ-תאיות המורפולוגיה דמוית הממברנה העגולה.