Name: מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת חלבוני ממברנה ומצבים נסתרים בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>1/4 גל</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>תוודא להתאים את הלייזר</td></tr><tr><td>מטרה נפט 100X</td><td>אולימפוס</td><td>12-563-659</td><td>1.45 N/A אפוכרומטי</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>ליפידים פולריים של Avanti</td><td>850457</td><td>פוספוליפידים של POPC</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 חינוך גופני</td><td>ליפידים פולריים של Avanti</td><td>880210</td><td>מלח אמוניום</td></tr><tr><td>עדשת 300 מ"מ</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>633 ננומטר He:Ne לייזר</td><td>מלס גריוט</td><td>05-LHP-927</td><td>ניתן לשנות אותו למקורות אחרים, ולאורכי גל אחרים</td></tr><tr><td>מסנן פס 633nm</td><td>כרומה טק</td><td>633/10X</td><td>התאמה ללייזר שבו משתמשים</td></tr><tr><td>מסנן מעבר ארוך 655nm</td><td>כרומה טק</td><td>ET655lp</td><td>שינוי כדי להתאים לאורכי הגל של הצבע/לייזר</td></tr><tr><td>אנדור סוליס הראשון</td><td>אנדור &nbsp;</td><td>אנדור סוליס הראשון</td><td>תוכנה ללכידת תמונות</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>אטו-טק</td><td>655 לספירה</td><td>שינוי NHS-Ester, ניתן להשתמש בכל צבע עם שינוי המתאים לעבודה על מולקולה בודדת. מומלץ להשתמש ב-ATTO אך ניתן להשתמש ב-Cy5/7</td></tr><tr><td>שרף SM-2 Bio-beads</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>כלוריד סידן</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>C3155-50MG</td><td>מכבד בקר, המסה מימית, &GE; 30,000 יחידות למ"ג</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC או דרגת ספקטרוסקופית</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי כיסוי</td><td>ESCO אופטיקס</td><td>R525000</td><td>קוורץ 25 מ"מ</td></tr><tr><td>מפצל קרן דיכרואי</td><td>סמרוק</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>שינוי כדי להתאים לאורכי הגל של הצבע/לייזר</td></tr><tr><td>מצלמת EMCCD</td><td>אנדור &nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון 15 מ"ל&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>188261</td><td>צינורות תרבית תאים של סלסטאר</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>G2133-50KU</td><td>מ-Aspergillus niger, טיפר VII, ועוד; 100000 יחידות/גרם מוצק (ללא תוספת חמצן)</td></tr><tr><td>אקדח חום</td><td>הארבור פריט</td><td>56434</td><td>בשימוש בחימום הפרפילם, בדרך כלל ניתן להשתמש בכל אקדח חום</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ביוריאגנטים של פישר</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>שמן אוטופלואורסצנציה נמוכה</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>מתונל</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC או דרגת ספקטרוסקופית</td></tr><tr><td>צינור מיקרו צנטריפוגה</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1.5 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרו פיפטרים</td><td>אפנדורף</td><td></td><td>מגוונים; 1000 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L ו-10 ומיקרו; L מומלץ</td></tr><tr><td>&Oslash; צינורות עדשה בקוטר 1.5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>החוט החיצוני מגולח לצורך הכנת דגימה</td></tr><tr><td>טבלה אופטית</td><td>ניופורט</td><td>RPR Reliance</td><td>גודל הטבל תלוי במרחב הזמין</td></tr><tr><td>רקמות אופטיות</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>ניקוי רכיבים שונים</td></tr><tr><td>פאראפילם</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>P7669</td><td>לוודא שאין פלואורסצנט מגזים במהלך התהליך</td></tr><tr><td>מפעיל פיזו</td><td>ניופורט</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>מבודדי רטט פנאומטיים</td><td>ניופורט</td><td>סדרת I-2000</td><td>משמש לייצוב הטבלה האופטית לכל אי-אחידות &nbsp;</td></tr><tr><td>אמבטיה מקוררת</td><td>פישר סיינטיפיק &nbsp;</td><td>איזוטמפ 3016</td><td></td></tr><tr><td>בקר תריס</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>מקושר לתוכנת ההדמיה</td></tr><tr><td>כלוריד נתרן</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>מסנן סטריטופ</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>דרייבר ובקר תיבת מתגים&nbsp;</td><td>ניופורט</td><td>PZC200</td><td>בקר במה</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>ג'יי.טי. בייקר</td><td>SF01-98</td><td>PES 25 מ"מ 0.2 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>אלמנט TEC</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>משמש לחיבור משאבת החום של פלטיר למחזיק הדגימה ולקולר המטרה</td></tr><tr><td>קונטלר טמפרטורה</td><td>מירסטטר הנדסה</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>גלאי טמפרטורה</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>תרמיסטור</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Tube-O-Dialyzer</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>4K MWCO</td></tr><tr><td>מנקה אוזון UV</td><td>נובסקן</td><td>PSDP_UV</td><td>סדרת פרו - דיגיטלית&nbsp;</td></tr><tr><td>זום אופטיקס &nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

tracking-single-proteins-lipid-bilayers-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

אנו מציגים שיטה של ​​הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

למדו מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת חלבוני ממברנה ומצבים נסתרים בתאים.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים