מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

חלבונים פועלים במרחב מצבים מורכב ורבים ממנו מוסתרים. אנחנו משתמשים בהדמיה של מולקולה בודדת כדי לחשוף מצבים אלו. בעת מעקב אחר חלבוני ממברנה בודדים בשכבת ליפידים, האתגרים העיקריים הם הכנת דגימות, הלבנת פוטו, ופתרון זמן.

כדי להתחיל, הוציאו את תמיסות גבעול השומן מהמקפיא ותנו להן להגיע לטמפרטורת החדר. הוצא בקבוק נקי של 10 מיליליטר מהתנור ותן לו להתקרר לטמפרטורת החדר. הוסף 900 מיקרוליטר כלורופורם בדרגת ספקטרוסקופ, ו-100 מיקרוליטר של מתנול בדרגת ספקטרוסקופ לבקבוק התחתית העגול המקורר.

לאחר מכן מוסיפים את הכמויות המתאימות מכל שומן לבקבוק וסובבו כדי לערבב היטב. עכשיו שים מחבר זיקוק ואקום מעל הבקבוק העגול התחתון וחבר אותו לקו הייבוש של החנקן. אחר כך מפעילים את גז החנקן ומכוונים את הלחץ עד שהזרימה מורגשת בקושי בגב היד.

פיפט מיליליטר אחד של בופר לכל חמישה מיקרומולים של שומן כולל אל הבקבוק העגול התחתון. הניחו פקק זכוכית על הבקבוק ואטום אותו עם סרט פרפין. מקם את הבקבוקון והמהדק על מעמד טבעת וטבול את תחתיתו באמבט סוניקטור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.

וודא שהתמיסה אטומה ושאין שומנים שמחוברים לדופן הפנימית של הבקבוקון. לאחר שעה של דגירה, הפעל את הסוניקטור והגדר את המשרעת לרמה הגבוהה ביותר. הזז את הבקבוקון בתוך האמבטיה כדי לאתר את המקום עם התערבול החזק ביותר שבו התמיסה בולטת ומתיזת בתוך הבקבוקון.

סוניקייט את התמיסה למשך 30 דקות. מתבונן במעבר מהאטימות לשקופה ומעט אופלסנטית. הסר את תמיסת השומנים מהבקבוק והעבר אותו לצינור מיקרו צנטריפוגה.

צנטריפוגה את הצינור ב-100,000 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, יש להסיר ולהעביר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש. הנח את מכסה הקוורץ בקוטר 25 מ"מ בתוך בקבוק והוסיף נפחים שווים של ננו מים טהורים, 30% מי חמצן וחומצה חנקתית מרוכזת.

חממו את המכסה ומחליקים בתמיסה המוכנה למשך 30 דקות עד שמתחילים לבעבע. בדוק את התמיסה כל 10 דקות וסובב בעדינות כדי למנוע מהכיסוי להידבק. שימו לב שהכיסוי מחליק ומתנתק במהלך הסיבוב.

לאחר ההפרדה, הפחיתו בהדרגה את מהירות הסיבוב כדי לשמור על ההפרדה ולאפשר לתמיסת הבועות לצפות את הכיסוי באופן אחיד. לאחר מכן שטוף היטב את המכסה במים מטוהרים תוך סיבוב עדין להסרת כל שאריות הכימיקלים. לחילופין, לנקות את חלקי הכיסוי של הקוורץ באמצעות n-הקסן ואחריו מתנול, תוך ניקוי עם רקמת עדשה לכל ממס.

הניחו את הכיסוי בתוך חומר ניקוי אוזון UV כאשר המשטח לטיפול פונה אל המנורה. אפשר לחמצן לזרום לתוך התא בקצב של חמישה פאונד לאינץ' רבוע למשך חמש דקות. ואז כבה את זרימת החמצן.

כעת הדלק את האורות האולטרה-סגולים למשך 15 דקות, ואז אפשר לכיסוי לנוח לפחות 10 דקות כדי לאפשר לאוזון להתפזר. הניחו כיסוי נקי זה עתה בתוך מחזיק דגימה בקוטר 25 מ"מ. באמצעות צינור עדשה אחת SM בקוטר רבע אינץ', חתך אטם סרט פר כפול בקוטר שמונה מ"מ וממקם אותו במרכז מחזיק הדגימה.

מרח טיפה של 50 מיקרוליטר של הוזיקולות החד-למריות הקטנות במרכז אטם שמונה מילימטר. לאחר סגירת התא, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה, השתמשו בפיפטה כדי לשטוף את התמיסה.

הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר טרי לשכבה הדו-שכבתית וחזרו על התהליך הזה בסך הכל 10 פעמים. לאחר השטיפה הסופית, הסר את הבופר ממחזיק הדגימה. הוסיפו אליקוט של 50 מיקרוליטר מהחלבון הרצוי לחומר ניקוי, כדי להבטיח שהריכוז נמצא או נמוך מהריכוז הקריטי של המיצלה.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות שעה כדי לאפשר שילוב חלבון, שטפו את הדגימה עם בופר כדי להסיר חלבון וחומר ניקוי לא משולב. הגדר את מהירות ההזזה האנכית של הפיקסל לכ-600 ננו-שניות והגביר את מתח השעון האנכי באמצעות מצב אוברקלוק. לאחר מכן הגדר את קריאת הפיקסלים האופקית למהירות המקסימלית.

כוון את הגיין של המגבר המקדים לשניים. הגדר את פלט המגבר לכפל אלקטרונים וקבע את רווח מכפיל האלקטרונים לרמה הגבוהה ביותר שלו. לאחר מכן הגדר את זמן החשיפה ל-25 מילישניות.

ודא שקצב הפריימים בפועל עולה במעט על זמן החשיפה. עכשיו כוון את עוצמת הלייזר עד שהאות יבלוט בבירור מהרעש הרקע. אסוף מספיק נתוני הדמיה כדי להניב לפחות 1000 מסלולים לכל דגימה.

לצורך ניתוח מעקב, חתוך את כל מערכי הנתונים לגודל אחיד ובצע תיקון רקע באמצעות Image J.In Fiji, גרור ושחרור את הסרט או הערימה של קובץ TIFF שצריך לנתח בממשק. כדי להזין את פרטי כיול הפיקסלים, עבור ללשונית ניתוח, בחר קנה מידה קבוע, והחלה את הפיקסל על כיול מרחק ספציפי למכשיר. לאחר מכן שמור עותק של מאגר הנתונים כדי לשמר את המקור ולעקוב אחרי כל שינוי שנעשה.

הפחיתו את הרקע מאזור שנבחר והחלו אותו על העותק השמור של הנתונים המקוריים. לך ללשונית התהליך ובחר להחסיר רקע. בלשונית התוספים, בחר מעקב, ואז trackmate כדי להפעיל את חלון הדיאלוג של trackmate לניתוח מעקב.

דרגת הסימון לטטראמרים של AQP 4 חושבה כ-4.12 באמצעות ספקטרומטריה נראית UV, וניתוח התפלגות פואסון הראה כי 98% מהטטראמרים נשאו לפחות מולקולת צבע פלואורסצנטי אחת. ההיסטוגרמה מראה התפלגות רחבה של גדלי צעדים התואמים לדיפוזיה של מערכים אורתוגונליים בגדלים שונים של חלקיקים, ומקדם הדיפוזיה הממוצע המחושב היה 0.0143 מיקרומטר רבוע לשנייה. בסרטון זה, זיהינו מצבים מרכזיים החשובים לויסוי אקוופורין 4 וכוחות תרמודינמיים נלווים להם.

פרוטוקול זה מבטל ניחושים ביצירת ממברנות ביומימטיות עם חלבוני טרנסממברנה מטוהרים, המתאימים למעקב אחרי מולקולה בודדת בזמן-לפס. מכונות חלבון הפועלות בנקודות מפנה במעקב חלבון בודד בזמן, מאפשרות תצפית ישירה על מסלולים, ענפים ומבוי סתום.