אפיון הפרשת וזיקולה חוץ-תאית שמקורם באדיפוציטים באמצעות מודל עכבר CD63-GFP Reporter In vivo ו-In Vitro

אנו חוקרים ווסיקולה חוץ-תאית שמקורם בדיפוציטים, EVs, כדי להגדיר את תפקידן ברקמת השומן, במיוחד כיצד הם מווסתים את השיח החוצה בין שדיפוציטים בוגרים לתאי האב שלהם. נכון לעכשיו אין מערכות in vivo לחקר הפרשות EV של שדיפוציטים, ופרוטוקולי הטיהור הקיימים עדיין אינם מותאמים במלואם. כדי להתחיל, השתמשו בטכניקת סטרילית לכריתת רקמת שומן מפשעתי מעכברים שהושמטו.

הניחו גרם אחד של רקמה בצינור של שני מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטר של בופר עיכול. באמצעות מספריים סטריליים, טחנו את הרקמה לחתיכות בגודל לא גדול ממילימטר אחד. הרחק את הרקמה הטחונה ב-10 מיליליטר של בופר עיכול המכיל 0.5 מיליגרם למיליליטר ליבראז ו-50 יחידות למיליליטר DNase I. דגר את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על מנער אורביטלי.

במהלך הדגירה, הפכו בעדינות את הצינור מספר פעמים. כאשר התמיסה נראית עכורה ואין שברי רקמה נראים לעין, העיכול הושלם. כדי לבודד חלק כלי דם סטרומלי או SVF, מדלל את התסמין המעובד בשני נפחים של בופר עיכול.

הפוך בעדינות את הצינור שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב היטב. העבירו את המתלה דרך פילטר סטרילי של 100 מיקרומטר להסרת רקמה לא מעוכלת, ואז צנטריפוגות את הסינון ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. סמנו את הכדור כ-SVF.

דגרו את חלק כלי הדם הסטרומלי בבופר פירוק תאי דם אדומים טרי על קרח למשך חמש דקות, מוגן מאור. הוסיפו שני נפחים של בופר שטיפה וצנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. החזירו את החלק הווסקולרי הסטרומי ב-80 מיקרוליטר של בופר לגרם רקמה והעבירו את התוכן לצינור חדש.

הוסף 20 מיקרוליטר של קוקטייל התרוקנות לא-שדיפוציטים לכל גרם רקמה. דגרו את הדגימה במשך 15 דקות בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בחושך. העבר את הדגימה דרך עמודת LS ואסוף את הזרימה שמכילה את חלק התא השלילי של השושלת.

צנטריפוגה את הזרימה בטמפרטורה של 300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל את תאי הקבורה של הדיפוציטים. דגרו 250 מיקרוליטר של תאי אב מבודדים של עכברים מבודדים של שומן בארות על שקופיות עם שמונה בארות מצופות קולגן למשך שש שעות. מקבע את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 10 דקות כדי לשמור על מבני הווסיקולות התאיות והחוץ-תאיות להדמיה.

לאחר מכן, שטפו את הסליידס שלוש פעמים עם PBS, ואז התקינו עם מדיום נגד דהייה. לאחר ספירת תאי האדיפוציטים, השעה אותם ודילל צבע חיוניות. דגרו על קרח במשך 20 דקות, מוגנים מאור.

שטוף את התאים פעם אחת עם בופר שטיפה וצנטריפוגה. תלו את התאים בבופר צביעה מבריק כך שהריכוז הסופי יהיה מיליון תאים ל-100 מיקרוליטר. חסום קשירה לא ספציפית על ידי הוספת תגובת חסימת קולטני Fc ביחס של אחד ל-100 והדגירה.

סובב חופשי את נוגדן SCA-1 ב-6000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו את נוגדן SCA-1 לצינור ה-APC בדילול של אחד עד 100, ואז הניחו את הצינור על קרח, מוגן מאור. שטפו את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של בופר שטיפה, ואז צנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השעינו את התאים בבופר שטיפה למיון ציטומטריית זרימה, ואז אספו את הנתונים עבור תאי SCA-1 חיוביים ו-GFP על ציטומטר זרימה ספקטרלי המצויד בלייזר סגול וכחול. כדי להתחיל את ההבדלה, ציפו את הכלים ב-0.2% ג'לטין, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זרעים APCs מבודדים זה עתה בתווך DMEM/F12 שהושלמו ודגרו עד למפגש (Connection).

החלף את המדיום מהיום הראשון ועד היום השמיני במדיום הבדלה אדיפוגני MesenCult. ביום התשיעי, שטפו את האדיפוציטים פעמיים עם PBS, ואז החליפו את המדיום במדיום תרבית שומן בוגר המכיל DMEM 1% BSA ו-0.2% פרימוסין. כדי לבודד ווסיקולות חוץ-תאיות המופרשות על ידי שומנים, תחילה מעבירים 15 מיליליטר של מדיום תרבית דרך מסנן של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן מסנן 30 מיקרומטר.

צנטריפוגה את הסינון ב-500 גרם למשך חמש דקות ואז צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-2000 גרם למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות תאים ופסולת. לאחר העברת הסופרנטנט המתקבל דרך מסנן של 0.8 מיקרומטר והעברת הסינון ליחידת אולטרה-פילטרציה בנפח 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב-4000 גרם למשך 15 דקות כדי לרכז את המדיום. טעינו את הדגימה המרוכזת על עמודת כרומטוגרפיה של החרגת גודל המחוברת לאספן שברים אוטומטי ואספו שברים F1 עד F8.To ביצוע ניתוח ווסטרן בלוט, ריכזו כל שבר מ-400 מיקרוליטר עד 25 מיקרוליטר.

פיפט 50 מיקרוליטר של בופר בדיקה רדיואימונופרציפיטציה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז. הוסיפו 75 מיקרוליטר של שני בופר טעינה 2X SDS כדי לדניטורציה של הדגימה ולפרק חלבונים על ג'ל טריס-גליצין של 4% עד 12%. לניתוח מעקב ננו-חלקיקים, יש לדלל דגימות ווסיקולה חוץ-תאית עם PBS סטרילי מסונן של 0.1 מיקרומטר ולערבב בעדינות.

טען את הדגימה המדוללת למכשיר NTA המצויד במצלמת מתכת תחמוצת משלימה למחצה ברגישות גבוהה ובלייזר ירוק בקוטר 532 ננומטר. הגדר גילוי לחלקיקים בין 10 ננומטרים ל-1,000 ננומטר, ובריכוז של 10 עד הספק של 6 עד 10 עד 9 חלקיקים למיליליטר. תאי אב שומן מעכברים של עצירה-להקה-להקה/CD63GFP לא הראו נקטות חלבון פלואורסצנטיות ירוקות ניתנות לזיהוי תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

בעוד שתאים מעכברי AdipCD63 הראו פנקטות חלבון פלואורסצנטיות ירוקות רבות ברחבי הציטופלזמה. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי 1.2% מהתאים החיוביים בגולגולת 1 בעכברי הדיווח הביעו חלבון פלואורסצנטי ירוק לעומת 12.6% בעכברי AdipCD63-GFP. שברי הכרומטוגרפיה של החרגת גודל במערב הראה שסמני ווסיקולות חוץ-תאיים CD63 ו-HSP70 הועשרו בחלקים F1 ו-F2. בעוד שסמנים של רשתית אנדופלזמית ומיטוכונדריה היו חסרים, מה שמאשר טוהר ווסיקלי.

ניתוח מעקב אחרי ננו-חלקיקים גילה כי ווסיקולות חוץ-תאיות שמקורם בשומן נע בגודלם בין 50 ננומטר ל-500 ננומטרים, ומיקרוסקופיית אלקטרונים במעבר אישרה שהוזיקלות מציגות מבנים ממברנתיים כפולים שלמים. ווסטרן בלוט אישר את הדחיפה של STX4 בשומנים (אדיפוציטים). מיקרוסקופיה קונפוקלית הראתה כי וזיקולות חיוביות ל-CD63-GFP התפזרו ברחבי הציטוזול אצל שדיפוציטים מסוג פראי, אך הצטברו סמוך לממברנת הפלזמה בשומרי STX4 שהפכו לנוקאאוט.

הריכוז של וזיקולות חוץ-תאיות שמקורן בשומן המופרש פחת משמעותית בשומרי STX4 בהשוואה לסוג פראי. כתם מערבי בכמויות חלבון שוות של וזיקולות תוך-תאיות הראה ביטוי מופחת של CD63 ו-CD81 בשומני STX4 שנקבעו בהשוואה לסוג פראי. הפרוטוקול מספק מערכת חזקה וניתנת לשחזור לחקר הפרשת EV של שומנים ב-vivo ובמבחנה, וכן שיטת טיהור אופטימלית של EV של שדיפוציטים.

הפרוטוקול, לראשונה, מתאר ומאשר את השימוש בצנטריפוגות מהירות סדרתיות במהירות נמוכה בשילוב עם כרומטוגרפיה של הדרת גודל כדי לטהר EVs שמקורם בשומנים בוגרים. הממצאים שלנו מאפשרים לנו לשאול שאלות חדשות לגבי האופן שבו שדיפוציטים משתמשים בווזיקולות חוץ-תאיות כדי לתקשר עם סוגי תאים אחרים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.