Name: Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למד את שיטת ChIP לרקמת מוח אנושית לאחר המוות כדי למפות מתילציה של היסטונים ורגולטורים אפיגנטיים. טכניקה זו מספקת הבנה מעמיקה של מנגנוני ביטוי גנים במוח תקין וחולה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות הנפש (5R01MH071476).

נוהל: 1 st יום 1. Homogenize 50-500 מ&quot;ג של רקמת שלאחר המוות אפור קפוא משנה עם Douncing חוצץ. ! זהירות - רקמה אנושית יש לטפל בזהירות תחת תנאי בטיחות מחמירים. זה צריך להיות מטופל בבית BSL-2 ומעלה תקני הבטיחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גזור בעבר, שלאחר המוות של המוח -80 ° C, dounce להם נפח מוח 5X של הצפת Douncing, ומכניסים צינור microcentrifuge 2.0 מ&quot;ל. בהתאמה מדגם זוגות לשלוט מעובדים בו זמנית. </li></ol> 2. Micrococcal nuclease (MN) עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5U/mL של Micrococcal nuclease המדגם ומערבבים תוך פתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה לפני הצבת על הקרח. * שלב קריטי - חשוב לעשות את הצעד הזה מהר מאז MN יש את היכולת לפעול על אף 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות 7 דקות 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 7 דקות, מוסיפים EDTA 0.5m ריכוז של 10mm להפסיק את פעילות MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום דגימות לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל בז. הוספת נפח 10X המדגם של 0.2mM EDTA, 1 / 2000 נפח דגימה של benzamidine 0.2M ונפח מדגם 1 / 1000 של phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). האחרון שתי תרכובות משמשים מעכבי פרוטאז. * שלב קריטי - חשוב לשמור את דגימות קרח במהלך כל השלבים הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מדגם שעה 1, בעוד vortexing זה כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה הארוכה שעה, להוסיף נפח דגימה 1 / 2000 של 3M DTT, עוד מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם וורטקס פעם נוספת צנטריפוגות ב RCF 3175 במשך 10 דקות ב 4 ° C. * שלב אופציונלי - Precleansing עם חלבון G agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח supernatant ולשים צינור חדש בז 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של חלבון G agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 4000 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ supernatant כך 500 μL משמשים לשלוט קלט (המכילים DNA הגנומי בלבד), והשאר מחולק לשני צינורות המכיל 1600 μL של המדגם כל - שהם עבור הכרומטין immunoprecipitation (שבב) דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת קלט ממוקם ב -80 ° CO / N עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי דגימות שבב - להוסיף נפח של 1:10 10XFSB ו 4μg של נוגדנים, ואז המערבולת דגימות ולסובב אותם 4 ° C למשך הלילה. ! זהירות - כמות דילול של הנוגדן עשוי לדרוש אופטימיזציה. </li></ol> 2 nd יום ! זהירות! - בגין יום 2 nd על ידי שטיפת חלבון G agarose אשר ישמשו לבודד DNA nucleosomal. מאז חרוזים agarose רגישים מאוד, יש צורך לנתק את ראשי טיפים בכל פעם pipetting כל תמיסה המכילה חרוזים agarose. 1. גשוש חלבון G חרוזים agarose ל-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.6 מ&quot;ל 1XFSB עד 245 μL חלבון ה-G-agarose (מספיק ל 4 צינורות) בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל (לולאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הפתרון לשתי 2 צינורות מ&quot;ל ולמלא כל אחד עד 1.6 מ&quot;ל עם 1X FSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב ב RT במשך 30 שניות ו צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.6 מ&quot;ל 1X FSB שוב. סובב את הדגימות למשך 30 שניות ואז צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant שוב, לשלב את שתי מבחנות עם 1.5 מ&quot;ל 1XFSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 זרע μL sonicated סלמון DNA (10mg/mL). ! זהירות - שלב זה אמור, באופן עקרוני, להפחית את הלא ספציפית מחייב immunoprecipitate אל חרוזים. עם זאת, זה גם יכול להוביל חיוביות שגויות עבור חלק (אדם) רצפי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב ב RT למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. הוספת 200 μL של 1XFSB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 μL של חרוזים agarose לתוך מדגם כל שבב. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של 1XFSB לתוך הנותרים חרוזים agarose לשמש מלאה שלילי לסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה ארוכה שעה, בצנטריפוגה דגימות ובקרה שלילי RCF 0.1 למשך 30 שניות. בטל supernatant. </li></ol> 2. כביסה חרוזים ! זהירות! - מאגרים כביסה יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, יש להשתמש בהם רק אם הם פחות מחודש הישן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של כל פתרון כביסה על חרוזים לסובב דקות 3 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 0.1 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל ואקום באמצעות supernatant. </li></ol> * פתרון כל כביסה - מלח נמוכה כביסה חיץ - מלח גבוהים כביסה חיץ </p&gt; - ליתיום כלוריד פתרון - רק לסובב ב RT דקה 1! - TE חיץ (10 mM טריס, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Elution * שלב קריטי - הפוך הצפת elution טריים עבור כל ניסוי ביום זה היא לשמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של חיץ טרי elution מוכן מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב במשך 15 דקות ב RT, אז צנטריפוגות ב RCF 0.4 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant בצינור 2.0 microcentrifuge מ&quot;ל (Loop). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של חיץ elution לטעום כל מערבולת ביד במשך כמה שניות. ואז, דגימות מערבולת במשך 15 דקות על mulitvortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 16 RCF סל&quot;ד במשך 4 דקות ולשמור אותו supernatant ב 2.0 מ&quot;ל צינור (Loop). </li></ol> 4. תקציר חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl EDTA 0.5m, 25 μl 0.8M טריס-HCl, pH 6.5, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K (1 / 200 לדוגמה) לדגום כל שבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט בכל קלט, להוסיף למאגר תמוגה לעיכול K proteinase (1 / 10 של חיץ מדגם) ו 10mg/ml proteinase K (1 / 200 חוצץ לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קלט דגימות שבב 52 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות. </li></ol> 5. פנול / כלורופורם מיצוי ! זהירות - ניסוי המחייב פנול / כלורופורם צריכה להתבצע מתחת למכסה המנוע. השתמש בכפפות בעת טיפול nitrile פנול / כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 3 שעות, נוסיף את 500 μl פנול, כלורופורם מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל וורטקס דגימות במשך כמה שניות, ואז צנטריפוגות בסל&quot;ד RCF 13 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו, בשני שלבים יהיו נוכחים ואנחנו מעוניינים בתוכן של השלב העליון. קח את השלב העליון והכניס אותו לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים תערובת של 2μL של גליקוגן 50μL של נתרן אצטט 3M מדגם זה יחד עם 1.375 מ&quot;ל של אתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל וורטקס דגימות במרץ. מניחים אותן -80 ° C במשך הלילה. </li></ol> 3 rd יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות טופס -80 ° C ומניחים אותם על הקרח להם להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 15 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant מבלי להפריע גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 75% קרים מדגם זה, ואז להפוך אותם 4-6 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה RCF ב 18 דקות 5 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant שוב ולאפשר כדורי לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כדורי מיובשים μL 50 של 4 מ&quot;מ טריס-HCl, pH8 ולאחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי במיוחד עבור החוקרים מעוניינים חתימות מתילציה היסטון ו / או ה-DNA של המוח האנושי, כי אלה סימנים הכרומטין ניתן נוטה פחות חפצים הנתיחה שלאחר המוות לעומת סוגים אחרים של שינויים, כולל acetylation (היסטון) ו זירחון 1, 2. המוח הנתיחה ניתנת ללימוד מונו nucleosomal ההכנות, ה-DNA נשאר מחובר, במידה רבה, את ההיסטונים הליבה, לפחות עם דגימות במרווחים autolysis נציג (הזמן בין מוות הקפאה / אחסון של הרקמה) בדרך כלל בטווח של כמה שעות עד 1.5 ימים 1. עם זאת, מונו nucl...

פתרונות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר nChIP Douncing: 10 mM טריס, 4 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM CaCl 2 כדי להתאים את ה-pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FSB 10x: 50 mM EDTA, 200 מ&quot;מ טריס, 500 mM NaCl כדי להתאים את ה-pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח חיץ נמוכה כביסה: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ&quot;מ טריס (pH 8), 150 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר מלח גבוהים כביסה: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ&quot;מ טריס (Ph 8), 500 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליתיום כלוריד הצפת: 1% IGEPAL CA-630, חומצה Deoxycholic 1%, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM טריס (pH 8), 0.25 מ &#39;LiCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE חיץ: 10 mM טריס (pH 8), 1 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר elution: 0.1M NaHCO 3, 1% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proteinase חיץ K העיכול (10X): 1M טריס, 50 mM EDTA, 2% SDS, NaCl 2M להתאים את pH עד 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 M Sodium Acetate: 24.61 גרם נתרן אצטט נטול מים (MW = 82.03) ב 100 מ&quot;ל של מים מזוקקים autoclaved. התאם ל-pH 5.2 באמצעות חומצה אצטית מרוכזת. </li></ul>

assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

מחלות נוירו כרונית כגון סכיזופרניה, מחלה דו קוטבית אוטיזם נחשבים כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים לגרום לשינויים epigenetic של ביטוי גנים לפתולוגיה מולקולרית אחרים. באופן מסורתי, עם זאת, מחקרים ביטוי במוח שלאחר המוות הוגבלו כימות mRNA או חלבון. המגבלות נתקל במחקר שלאחר המוות המוח כגון variabilities בזמן autolysis ו integrities רקמות עשויים גם להשפיע מחקרים של מבנים גבוהים על מנת הכרומטין. עם זאת, הארגון nucleosomal של הדנ&quot;א הגנומי כולל ה-DNA: ליבה היסטון מחייב - נראה להישמר בעיקר מדגמים מייצגים הניתנים על ידי בנקים שונים במוח. לפיכך, ניתן ללמוד את דפוס מתילציה ושינויים קוולנטיים אחרים של ההיסטונים הליבה לוקוסים הגנומי מוגדרים במוח שלאחר המוות. כאן, אנו מציגים פשוטה יליד הכרומטין immunoprecipitation (NChIP) פרוטוקול קפוא (לא קבועה) דגימות מוח אנושי. החל העיכול nuclease micrococcal homogenates של המוח, בעקבות NChIP ידי qPCR ניתן להשלים בתוך שלושה ימים. המתודולוגיה המוצגת כאן צריך להיות שימושי להבהיר מנגנוני epigenetic של ביטוי גנים במוח אנושיים בריאים וחולים.

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

מחלות נוירופסיכיאטריות כרוניות, כגון סכיזופרניה, הפרעה ביפולרית ואוטיזם, נחשבות כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים...

שלום, אני Amish Matan ואני מהמעבדה של Dr.Sha Mc Barian כאן במחלקה לפסיכיאטריה של UMass Medical School. היום אדגים לכם הליך של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) ברקמת מוח אנושית לאחר המוות. למרות שההליך הבא אינו מורכב מאוד.הדבר המרגש ביותר הוא שעד לא מזמן, מחקרי ביטוי במוח האנושי היו מוגבלים לכימות פשוט של mRNA וחלבון. טכניקה ספציפית זו תעניק לנו הבנה טובה יותר של הבסיס המכניסטי של ביטוי גנים במוח אנושי תקין ובמוח חולה. לכן, בואו נתחיל בביצוע שיקוע חיסוני של כרומטין.התחלנו עם רקמות מוח אנושיות לאחר המוות שהופשרה והופרדה מבעוד עם. חשוב להשתמש במשקפי מגן ולעבוד באזור המיועד לטיפול ברקמות אנושיות. בעת עיבוד דגימות אלו, רקמת המוח מוסבת עם פי חמישה מנפח המוח של down sink buffer.ברגע שכל הרקמה נראית הומוגנית בתוך התמיסה, ניתן להעבירה למבחנה בנפח של שני מיליליטר. לאחר שהרקמה עברה הומוגניזציה, יש להוסיף לדגימה חמש יחידות לכל מיליליטר של micro coccal nuclease ולערבב את התמיסה באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת בפיפט. לאחר מכן, יש להניח את המבחנה על קרח.חשוב לבצע שלב זה במהירות, מכיוון שלמיקרוקוקאל נוקלאס יש יכולת לפעול אף בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שכל הדגימות טופלו במיקרוקוקאל נוקלאס, נעביר אותן במהירות למקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C ונדגיר את הדגימות למשך שבע דקות.לאחר דגירה של שבע דקות, נוסיף EDTA בריכוז 0.5 מולרי עד להגעה לריכוז של 10 מילימול כדי לעצור את פעילות ה-micrococcal nuclease. כעת אנו מוכנים לעבור לשלב ה-ionization. לאחר שטיפלנו בדגימות ב-micrococcal nuclease, הדגימות המכילות את ה-DNA הנוקלאוזומלי יעברו ionization.נווה תיקח מבחנה מסוג Falcon בנפח 15 ml, אליה נוסיף 4.5 ml של EDTA בריכוז 0.2 mM, 2.5 µl של benadine בריכוז 0.2 M, ו-4.5 µl של PMSF בריכוז 0.1 M. לאחר מכן נעביר את הדגימה למבחנה. כעת נדגיר את הדגימה למשך שעה על קרח, תוך ערבוב במערבל Vortex בכל 10 דקות.בסיום הדגירה שנמשכת שעה, נוסיף 2.5 µL של DTT בריכוז 3 M. נערבב את הדגימה שוב במכשיר vortex, ולאחר מכן נסבב אותה בצנטריפוגה עם רטור מסוג swing bucket ב-3,175 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, נחלק את supernatant, כך ש-500 µL ישמשו כבקרת קלט (input control), שתכיל DNA גנומי בלבד, והשאר תחולק לשתי מבחנות המכילות 1,600 µL של דגימה בכל אחת, אשר ישמשו כדגימות ה-chromatin immunoprecipitation שלנו.את בקרת הקלט שומרים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך הלילה עד לשימוש הבא. לאחר מכן, מוסיפים 160 מיקרוליטר של 10 XFSB, שמהווים עשירית מנפח הדגימה שלנו. יחד עם זאת, מוסיפים ארבעה מיקרוגרם של הנוגדן.כעת ערבבו את הדגימות במערבל Vortex, ולאחר מכן סובבו אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה, נשטוף את חרוזי החלבון שישמשו לבידוד ה-nucleosomal DNA שלנו. מכיוון שחרוזי האגרו הללו רגישים מאוד, יש לקטום את קצותיהם של טיפי הפפיטה בעת העבודה איתם.זאת כדי להבטיח שיהיה למסבים (beads) מרחב גדול יותר בזמן הפעולה עם הפיפט. כעת, הוסיפו 1.6 mils של מסב XFS אחד ל-245 microliters של protein jaguars לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 2 mils. כמות זו אמורה להספיק לארבעה מבחנות של דגימה.בשלב הבא, חלק את תמיסת החרוזים לשתי מבחנות בנפח 2 מיליליטר ומלא כל אחת מהן עד לנפח של 1.6 מיליליטר באמצעות XFSB אחד. סובב את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות באמצעות רוטטור, ולאחר מכן סבב אותן בצנטריפוגה ב-0.1 RCF למשך 30 שניות. לאחר הסבב בצנטריפוגה, הסר את ה-ATE באמצעות ואקום.הוסיפו 1.6 µL של one XFSB. פעם נוספת, סובבו את הדגימות במשך 30 שניות על רב-סובב (rotator) ולאחר מכן סבבו אותן שוב בצנטריפוגה ב-0.1 RCF FS למשך 30 שניות. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו שוב את הנוזל העליון (supernatant) ואחדו את שתי המבחנות עם 1.5 µL של one XFSB.הוסיפו גם 15 µL של DNA מזרע. כעת סובבו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן סובבו במ centri-fuge ב-0.1 RCF למשך 30 שניות. הסירו את העילוי והוסיפו 200 µL של one XFSB.כעת הוסיפו 90 µL של agro speeds לכל דגימת שיקוע כרומטין, ולאחר מכן סובבו אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת. עבור ביקורת שלילית, הוסיפו 1 mL של 1X FSB ל-agro speeds שנותרו, וסובב אותם יחד עם דגימת השיקוע החיסוני של הכרומטין ב-4 °C למשך שעה אחת. במהלך הדגרה זו, שנמשכת שעה אחת, ניתן לנצל את ההזדמנות להכין בופר רזולוציה טרי.שלב זה יבוצע בהמשך הניסוי, לאחר שעת הדגרה. סנטריפוג את הדגימות ואת הביקורת השלילית ב-0.1 CFS למשך 30 שניות והסר את הנוזל העליון. לאחר מכן, נשטוף את החרוזים בארבעה סוגים שונים של תמיסות שטיפה: בופר שטיפה עם ריכוז מלח נמוך, בופר שטיפה עם ריכוז מלח גבוה, תמיסת ליתיום כלוריד, ולבסוף, בופר TE ב-pH 8.עבור כל תמיסת בופר למעט תמיסת הליתיום כלוריד, נסובב את הדגימות למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן נסחרר אותן ב-0.1 R Cs למשך 30 שניות. עבור שטיפת הליתיום כלוריד, נסובב את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת בלבד. לאחר כל שטיפה, נשליך את העלייה באמצעות ואקום.כעת אנו מוכנים לשלב אלוציית הדגימות. כדי להתחיל את שלב האלוציה, נוסיף 250 µL של בופר אלואציה שהוכן טרי לכל דגימה. נסובב את הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן נסחרר במהירות של 0.4 RCF למשך דקה אחת.כעת שמרו את העל-נוזל (supernatant) באקום כתום של 2 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של תמיסת אלואציה (evolution buffer) לכל דגימה. שוב, ערבבו את כולן באמצעות וורטקס ידני למשך מספר שניות.לאחר מכן, ערבבו את הדגימות במערבל (vortex) למשך 15 דקות, ואחרי 15 דקות של ערבוב, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה. הגדירו 16 RCF למשך ארבע דקות ושמרו את העמלין (snat) באותה מבחנת 2 מיליליטר. כדי לעכל את החלבון בדגימות שלנו, הוסיפו תחילה לכל דגימה של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) 10 µL של 0.5 molar DTA, 25 µL של 0.8 molar Tris-HCl ב-pH של 6.5, ו-2.5 µL של 10 mg/mL proteinase K.הוסיפו לכל אחת מבקרות הקלט 15 µL של לysis buffer ו-2.5 µL של Proteinase K בריכוז 10 mg/mL. הדגרימו את דגימות הקלט ואת דגימות ה-chromatin immunoprecipitation בטמפרטורה של 52 °C למשך שלוש שעות לפחות. כעת, עם סיום הדגירה של שלוש השעות, ניתן להמשיך ולהתחיל במיצוי פנול-כלורופורם.לאחר דגירה של שלוש שעות, נוסיף 500 µL של פניל כלורפורם לכל דגימה. פעולה זו תתבצע במכסה העשן, מכיוון שפניל כלורפורם הוא כימיקל אורגני המזיק הן במגע עם העור והן בשאיפה. לאחר מכן, נערבב את כל הדגימות בוורטקס למשך מספר שניות ונצנטריפוג אותן ב-13 RCF למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה.שתי פאזות צריכות להיות נוכחות בתוך המבחנות. מכיוון שאנו מעוניינים בתכני הפאזה העליונה, נוציא את הפאזה העליונה ונעביר אותה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח של 2 ml. לאחר מכן, תערובת של 2 µL גליקוגן ו-50 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M תתווסף לכל דגימה, יחד עם 1.375 ml של אתנול בריכוז 100%.את כל הדגימות מערבלים במיקסר וורטקס בעוצמה רבה ומקפיאים בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה. לאחר הדגרה של לילה, מניחים את הדגימות על קרח להפשרה. לאחר מכן, מבצעים להם סנטריפוגה בצפיפות ב-15 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.לאחר סנטריפוגציה, הסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע בתחתית המבחנה. לאחר מכן, הוסף 1 mL של אתנול קר בריכוז 75% לכל דגימה והפוך את המבחנות ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן, בצע סנטריפוגציה חוזרת למבחנות ב-18 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.הנוזל העליון מוסר שוב ומשאירים את המשקעים להתייבש באוויר. לאחר שהמשקעים יבשים, הם מומסים ב-50 µL של trace HCL בריכוז four millimolar ו-pH 8, ונשמרים בטמפרטורה של 80- °C עד לשימוש הבא. ובכן, הראיתי לכם כיצד לבצע שיקוע אימונו-חומרי צבעין (chromatin immuno precipitations) ברקמת מוח אנושית קפואה לאחר המוות.וזכרו, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנקוט בכל אמצעי הזהירות הנדרשים בעבודה עם רקמת מוח אנושית. ניתן להשתמש בבדיקות כרומטין ואימונו-משקיעה (immunoprecipitation) כדי להוסיף רובד נוסף של הבנה לגבי ביטוי גנים הן במוח האנושי התקין והן במוח חולה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

מקור: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin immunoprecipitation using Moine Tumor Tumor Neurospheres. J. Vis. exp. (2018). סרטון זה מדגים את הבידוד של קומפלקסים של חלבון-DNA מתאי נוירוספרה שמקורם בגידול מוח של עכבר באמצעות משקעים חיסוניים מקוריים של כרומטין. הוא מפרט את השלבים להכנת כרומטין, משקעים חיסוניים, שטיפה ועיכול חלבון לשחרור DNA לניתוח במורד הזרם.

כרומטין מקורי אימונו-משקעים של תאי נוירוספרה

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

כאן אנו מתארים שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון 5mC המבוססת על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז והגברת אות טירמיד.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

מנגנוני epigenetic משתנים לעתים קרובות ב glioma. כרומטין immunoprecipitation יכול לשמש כדי לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים ב glioma הנובעות משינויים שינויים היסטון המסדירה שעתוק גנים ומבנה כרומטין. פרוטוקול זה מתאר כרומטין יליד immunoprecipitation על המוח מאתר הגידול neurospheres.

כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

למד את שיטת ChIP לרקמת מוח אנושית לאחר המוות כדי למפות מתילציה של היסטונים ורגולטורים אפיגנטיים. טכניקה זו מספקת הבנה מעמיקה של מנגנוני ביטוי גנים במוח תקין וחולה.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

גלה סרטונים נוספים