Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

שלום, אני Amish Matan ואני מהמעבדה של Dr.Sha Mc Barian כאן במחלקה לפסיכיאטריה של UMass Medical School. היום אדגים לכם הליך של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) ברקמת מוח אנושית לאחר המוות. למרות שההליך הבא אינו מורכב מאוד.

הדבר המרגש ביותר הוא שעד לא מזמן, מחקרי ביטוי במוח האנושי היו מוגבלים לכימות פשוט של mRNA וחלבון. טכניקה ספציפית זו תעניק לנו הבנה טובה יותר של הבסיס המכניסטי של ביטוי גנים במוח אנושי תקין ובמוח חולה. לכן, בואו נתחיל בביצוע שיקוע חיסוני של כרומטין.

התחלנו עם רקמות מוח אנושיות לאחר המוות שהופשרה והופרדה מבעוד עם. חשוב להשתמש במשקפי מגן ולעבוד באזור המיועד לטיפול ברקמות אנושיות. בעת עיבוד דגימות אלו, רקמת המוח מוסבת עם פי חמישה מנפח המוח של down sink buffer.

ברגע שכל הרקמה נראית הומוגנית בתוך התמיסה, ניתן להעבירה למבחנה בנפח של שני מיליליטר. לאחר שהרקמה עברה הומוגניזציה, יש להוסיף לדגימה חמש יחידות לכל מיליליטר של micro coccal nuclease ולערבב את התמיסה באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת בפיפט. לאחר מכן, יש להניח את המבחנה על קרח.

חשוב לבצע שלב זה במהירות, מכיוון שלמיקרוקוקאל נוקלאס יש יכולת לפעול אף בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שכל הדגימות טופלו במיקרוקוקאל נוקלאס, נעביר אותן במהירות למקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C ונדגיר את הדגימות למשך שבע דקות.

לאחר דגירה של שבע דקות, נוסיף EDTA בריכוז 0.5 מולרי עד להגעה לריכוז של 10 מילימול כדי לעצור את פעילות ה-micrococcal nuclease. כעת אנו מוכנים לעבור לשלב ה-ionization. לאחר שטיפלנו בדגימות ב-micrococcal nuclease, הדגימות המכילות את ה-DNA הנוקלאוזומלי יעברו ionization.

נווה תיקח מבחנה מסוג Falcon בנפח 15 ml, אליה נוסיף 4.5 ml של EDTA בריכוז 0.2 mM, 2.5 µl של benadine בריכוז 0.2 M, ו-4.5 µl של PMSF בריכוז 0.1 M. לאחר מכן נעביר את הדגימה למבחנה. כעת נדגיר את הדגימה למשך שעה על קרח, תוך ערבוב במערבל Vortex בכל 10 דקות.

בסיום הדגירה שנמשכת שעה, נוסיף 2.5 µL של DTT בריכוז 3 M. נערבב את הדגימה שוב במכשיר vortex, ולאחר מכן נסבב אותה בצנטריפוגה עם רטור מסוג swing bucket ב-3,175 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, נחלק את supernatant, כך ש-500 µL ישמשו כבקרת קלט (input control), שתכיל DNA גנומי בלבד, והשאר תחולק לשתי מבחנות המכילות 1,600 µL של דגימה בכל אחת, אשר ישמשו כדגימות ה-chromatin immunoprecipitation שלנו.

את בקרת הקלט שומרים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך הלילה עד לשימוש הבא. לאחר מכן, מוסיפים 160 מיקרוליטר של 10 XFSB, שמהווים עשירית מנפח הדגימה שלנו. יחד עם זאת, מוסיפים ארבעה מיקרוגרם של הנוגדן.

כעת ערבבו את הדגימות במערבל Vortex, ולאחר מכן סובבו אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. לאחר הדגירה של הלילה, נשטוף את חרוזי החלבון שישמשו לבידוד ה-nucleosomal DNA שלנו. מכיוון שחרוזי האגרו הללו רגישים מאוד, יש לקטום את קצותיהם של טיפי הפפיטה בעת העבודה איתם.

זאת כדי להבטיח שיהיה למסבים (beads) מרחב גדול יותר בזמן הפעולה עם הפיפט. כעת, הוסיפו 1.6 mils של מסב XFS אחד ל-245 microliters של protein jaguars לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגה של 2 mils. כמות זו אמורה להספיק לארבעה מבחנות של דגימה.

בשלב הבא, חלק את תמיסת החרוזים לשתי מבחנות בנפח 2 מיליליטר ומלא כל אחת מהן עד לנפח של 1.6 מיליליטר באמצעות XFSB אחד. סובב את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות באמצעות רוטטור, ולאחר מכן סבב אותן בצנטריפוגה ב-0.1 RCF למשך 30 שניות. לאחר הסבב בצנטריפוגה, הסר את ה-ATE באמצעות ואקום.

הוסיפו 1.6 µL של one XFSB. פעם נוספת, סובבו את הדגימות במשך 30 שניות על רב-סובב (rotator) ולאחר מכן סבבו אותן שוב בצנטריפוגה ב-0.1 RCF FS למשך 30 שניות. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו שוב את הנוזל העליון (supernatant) ואחדו את שתי המבחנות עם 1.5 µL של one XFSB.

הוסיפו גם 15 µL של DNA מזרע. כעת סובבו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן סובבו במ centri-fuge ב-0.1 RCF למשך 30 שניות. הסירו את העילוי והוסיפו 200 µL של one XFSB.

כעת הוסיפו 90 µL של agro speeds לכל דגימת שיקוע כרומטין, ולאחר מכן סובבו אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת. עבור ביקורת שלילית, הוסיפו 1 mL של 1X FSB ל-agro speeds שנותרו, וסובב אותם יחד עם דגימת השיקוע החיסוני של הכרומטין ב-4 °C למשך שעה אחת. במהלך הדגרה זו, שנמשכת שעה אחת, ניתן לנצל את ההזדמנות להכין בופר רזולוציה טרי.

שלב זה יבוצע בהמשך הניסוי, לאחר שעת הדגרה. סנטריפוג את הדגימות ואת הביקורת השלילית ב-0.1 CFS למשך 30 שניות והסר את הנוזל העליון. לאחר מכן, נשטוף את החרוזים בארבעה סוגים שונים של תמיסות שטיפה: בופר שטיפה עם ריכוז מלח נמוך, בופר שטיפה עם ריכוז מלח גבוה, תמיסת ליתיום כלוריד, ולבסוף, בופר TE ב-pH 8.

עבור כל תמיסת בופר למעט תמיסת הליתיום כלוריד, נסובב את הדגימות למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן נסחרר אותן ב-0.1 R Cs למשך 30 שניות. עבור שטיפת הליתיום כלוריד, נסובב את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת בלבד. לאחר כל שטיפה, נשליך את העלייה באמצעות ואקום.

כעת אנו מוכנים לשלב אלוציית הדגימות. כדי להתחיל את שלב האלוציה, נוסיף 250 µL של בופר אלואציה שהוכן טרי לכל דגימה. נסובב את הדגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן נסחרר במהירות של 0.4 RCF למשך דקה אחת.

כעת שמרו את העל-נוזל (supernatant) באקום כתום של 2 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של תמיסת אלואציה (evolution buffer) לכל דגימה. שוב, ערבבו את כולן באמצעות וורטקס ידני למשך מספר שניות.

לאחר מכן, ערבבו את הדגימות במערבל (vortex) למשך 15 דקות, ואחרי 15 דקות של ערבוב, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה. הגדירו 16 RCF למשך ארבע דקות ושמרו את העמלין (snat) באותה מבחנת 2 מיליליטר. כדי לעכל את החלבון בדגימות שלנו, הוסיפו תחילה לכל דגימה של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) 10 µL של 0.5 molar DTA, 25 µL של 0.8 molar Tris-HCl ב-pH של 6.5, ו-2.5 µL של 10 mg/mL proteinase K.

הוסיפו לכל אחת מבקרות הקלט 15 µL של לysis buffer ו-2.5 µL של Proteinase K בריכוז 10 mg/mL. הדגרימו את דגימות הקלט ואת דגימות ה-chromatin immunoprecipitation בטמפרטורה של 52 °C למשך שלוש שעות לפחות. כעת, עם סיום הדגירה של שלוש השעות, ניתן להמשיך ולהתחיל במיצוי פנול-כלורופורם.

לאחר דגירה של שלוש שעות, נוסיף 500 µL של פניל כלורפורם לכל דגימה. פעולה זו תתבצע במכסה העשן, מכיוון שפניל כלורפורם הוא כימיקל אורגני המזיק הן במגע עם העור והן בשאיפה. לאחר מכן, נערבב את כל הדגימות בוורטקס למשך מספר שניות ונצנטריפוג אותן ב-13 RCF למשך חמש דקות לאחר הצנטריפוגה.

שתי פאזות צריכות להיות נוכחות בתוך המבחנות. מכיוון שאנו מעוניינים בתכני הפאזה העליונה, נוציא את הפאזה העליונה ונעביר אותה למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח של 2 ml. לאחר מכן, תערובת של 2 µL גליקוגן ו-50 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M תתווסף לכל דגימה, יחד עם 1.375 ml של אתנול בריכוז 100%.

את כל הדגימות מערבלים במיקסר וורטקס בעוצמה רבה ומקפיאים בטמפרטורה של 80°C- למשך לילה. לאחר הדגרה של לילה, מניחים את הדגימות על קרח להפשרה. לאחר מכן, מבצעים להם סנטריפוגה בצפיפות ב-15 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.

לאחר סנטריפוגציה, הסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע בתחתית המבחנה. לאחר מכן, הוסף 1 mL של אתנול קר בריכוז 75% לכל דגימה והפוך את המבחנות ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן, בצע סנטריפוגציה חוזרת למבחנות ב-18 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

הנוזל העליון מוסר שוב ומשאירים את המשקעים להתייבש באוויר. לאחר שהמשקעים יבשים, הם מומסים ב-50 µL של trace HCL בריכוז four millimolar ו-pH 8, ונשמרים בטמפרטורה של 80- °C עד לשימוש הבא. ובכן, הראיתי לכם כיצד לבצע שיקוע אימונו-חומרי צבעין (chromatin immuno precipitations) ברקמת מוח אנושית קפואה לאחר המוות.

וזכרו, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנקוט בכל אמצעי הזהירות הנדרשים בעבודה עם רקמת מוח אנושית. ניתן להשתמש בבדיקות כרומטין ואימונו-משקיעה (immunoprecipitation) כדי להוסיף רובד נוסף של הבנה לגבי ביטוי גנים הן במוח האנושי התקין והן במוח חולה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.