Name: טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למדו שיטת טיטרציה לנגיפי קורונה האדם באמצעות Assay אימונופרוקסידאזה. פרוטוקול זה מציע חלופה אמינה לשיטות plaque assay לווירוסים ללא השפעות ציטופתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול טקסט מלא לגישה זו ניסיוני זמין <a href="http://www.springerprotocols.com/">הפרוטוקולים שפרינגר</a> .

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש assay אימונו

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

חישוב titers ויראלית מדבקת מייצג גישה ניסויית בסיסי וחיוני וירולוגים. מבחני פלאק קלאסית אינו יכול לשמש לאיתור וירוסים שלא לגרום לתופעות cytopathic משמעותי, אשר במקרה של זנים 229E ו OC43 של קורונה האנושי (HCoV). Assay חלופה אימונו עקיף (IPA) מתואר במסמך לאיתור טיטרציה של וירוסים אלה. תאים רגישים הם מחוסן עם דילולים לוגריתמי הסידורי של דגימות צלחת 96-היטב. לאחר צמיחה ויראלי, זיהוי נגיפי ידי IPA התשואות titer וירוס מדבק, כפי שבאה לידי ביטוי &quot;מנה רקמות תרבות זיהומיות&quot; (TCID50). זה מייצג את הדילול של מדגם המכיל וירוסים בו חצי שורה של בארות מעבדה להכיל וירוס שכפול. טכניקה זו שיטה אמינה עבור טיטרציה של HCoV דגימות ביולוגיות (תאים, רקמות או נוזלי).

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה חלופית לזיהוי titering של וירוסים באמצעות זיהוי אנטיגן האנזימטית טכניקה המכונה assay אימונו. כאן, אנו יראה לכם כיצד לאסוף דגימות ויראליות שלך, להכין את התאים לבדיקה, ולבסוף assay באמצעות אימונו דילולים סדרתי כדי לקבוע את titer ויראלי.

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

קביעת טיטרי זיהום נגיפיים היא גישה ניסויית בסיסית וחיונית עבור וירולוגים. לא ניתן להשתמש בבדיקות פלאק (plaque assays) קלאסיות עבור...

חישוב טריטרים ויראליים זיהומיים הוא גישה ניסיונית בסיסית. עם זאת, השיטה הקלאסית של שימוש במבחני פלאקים אינה האמינה ביותר עבור וירוסים שאינם גורמים לאפקטים ציטופתים, כגון קורונה-וירוסים אנושיים. בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה חלופית לזיהוי וטיטר של וירוס באמצעות טכניקת זיהוי אנטיגנים אנזימטית הידועה כמבחן אימונו-פרוקסידאז.כאן נראה לכם כיצד לאסוף את הדגימות הוויראליות שלכם, להכין את התאים לבדיקה, ולבסוף, לבצע את בדיקת האימונו-פרוקסידאז באמצעות דילול סדרתי לקביעת הטיטר הוויראלי. שלום, שמי ד"ר פייר אלבו, מנהל המעבדה לנוירואימונולוגיה במכון AM RIP בלאוואל, קוויבק, קנדה. היום נדגים כיצד לכמת זני וירוסי human color viruses‏ OT 43 ו-two nine E, שהם זני פרוטוטיפ של וירוסים אלו שאינם יוצרים פלאקים בתרבית.לכן פיתחנו בדיקה כדי לעקוף בעיה זו. היא נקראת בדיקת Immunoperoxidase. כדי להדגים פרוטוקול זה, אציג בפניכם את התלמידה שלי, Gabrielle Marol, את הטכנאי שלי Francis Nader, ואת עמית המחקר שלי Ellan Jacob.אם כן, נתחיל. ראשית, עלינו להכין את דגימות הרקמה שלנו. נתחיל בשקילה מוקדמת של המבחנות הסטריליות שבהן נשתמש לאיסוף של כל איבר.לאחר שקבענו את משקלן של כל המבחנות הריקות, נבצע דיסקציה מהירה של האיברים הרלוונטיים בתנאים סטריליים, ולאחר מכן נשמור אותם על קרח. חשוב לזכור לשטוף את המכשירים ב-70% ethanol בין דיסקציה אחת לשנייה. לאחר איסוף האיברים, נקבע את משקלו של כל דגימה ביולוגית.בשלב הבא, נבצע הומוגניזציה של דגימות הרקמה ב-10% sterile PBS באמצעות הומוגניזטור Polytron תחת מ মনזרימת אוויר למינרית. הפעילו את ההומוגניזטור ולאחר מכן הרימו והורידו את המבחנה כדי לפרק את הרקמה. לאחר הומוגניזציה של כל דגימה, שטפו את המכשיר פעם אחת במים סטריליים, פעם אחת ב-70% ethanol, ולבסוף ב-PBS לפני עיבוד דגימת הרקמה הבאה.לאחר הומוגניזציה של הדגימות, סבב את המבחנות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. ב-1000 Gs אסוף את העל-נוזל (supernatants) למבחנות סטריליות חדשות. בשלב זה, ניתן לעבד את דגימות הווירוס לזיהוי באמצעות אימונו-פרוקסידאז.לחלופין, ניתן להקפיאם מיד בטמפרטורה של minus 80 °C ולאחסנם עד למועד ביצוע הבדיקות. בשלב הבא, נכין את דגימות התאים. קיימות שיטות שונות להכנת תאים נצמדים ותאים לא-נצמדים, אך שתיהן כוללות איסוף של טיטרים ויראליים תוך-תאיים וחוץ-תאיים.על מנת לקבוע את הייצור הוויראלי החוץ-תאי בתאים דבקים, אנו אוספים על-נוזלים ושפופרות סטריליות מהתאים המודבקים, אשר ייבחנו במועדים המתאימים לאחר ההדבקה. להערכת תתרי הנגיפים התוך-תאיים, עלינו להסיר תחילה את המצע, לשטוף את התאים ב-PBS חמים וסטרילי, ולאחר מכן להוסיף את אותו הנפח או נפח ידוע של מצע, ולבצע שלושה מחזורי הפשרה חופשית ממינוס 80 מעלות צלזיוס. פעולה זו תגרום לליזיס של התאים ותשחרר חלקיקי נגיף אל המצע.עבור תאים שאינם נצמדים, אנו סבובים תחילה את התאים ב-1,000 ×g למשך חמש דקות. לאחר השקעת התאים, אנו אוספים את העלייה (supernatants) למבחנות סטריליות. חלק זה מייצג את החלק החוץ-תאי של הווירוס הזיהומי.בשלב הבא, נשעה את משקע התאים בנפח זהה לנפח העל-נוזל שנאסף או בנפח ידוע של מצע גידול. כעת נבצע שלושה מחזורי הקפאה והפשרה בטמפרטורה של 80°C- כדי לבלוע את התאים ולשחרר חלקיקי נגיף אל המצע. חלק זה מייצג את מרכיב הנגיף הזיהומי התוך-תאי.לאחר ליזיס של תאים דבקים או תאים שאינם דבקים, סבב אותם בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1,000 ×g. כעת ניתן לאסוף את הנוזל העליון למבחנות סטריליות חדשות ולנתח את הטיטרים באמצעות בדיקת אימונו-פרוקסידאז. לחלופין, ניתן להקפיא את הדגימה באופן מיידי ב-80°C- ולאחסנה עד לביצוע הבדיקה.על מנת לבחון את פריון הזיהום של קורונה-וירוס אנושי בדגימות הביולוגיות שלנו, ברצוננו להשתמש במבחן אימונו-פרוקסידאז על תאים הרגישים לקורונה-וירוס. ראשית, נעשה שימוש בטריפסינציה וטיפול כדי ליצור תליה של תאים רגישים משכבת מונושכבה מלאה (confluent monolayer). בעבודה עם קורונה-וירוס אנושי, נעשה שימוש בתאי 2 29 EL 1 32 כתאים רגישים, ועבור קורונה-וירוס אנושי OC 43, נעשה שימוש בקו התאים HRT 18 לאחר יצירת תליה של תאים רגישים. התאים נזרעים בלוח 96 בארי לתרבית רקמה.אם משתמשים בפיפט רב-ערוצי, יש להעביר 100 µL של תרחיף תאים לכל באער, בריכוז התאים המתאים. מספר התאים הרגישים לכל באער יהיה תלוי בסוג התאים שנעשה בהם שימוש ובמועד ביצוע הזרעת התאים. לאחר הזריעה, ניתן לעיין בפרוטוקול של Springer לקבלת מידע מפורט יותר.לפני תחילת בדיקת האימונו-פרוקסידאז, יש להדביק את התאים הרגישים בדגימות שהכנו קודם לכן. כאשר התאים הרגישים מגיעים ל-70 עד 80% confluence, יש להסיר את המצע מכל פלטת 96 בארות על ידי עטיפת הפלטה בנייר ספיגה סטרילי והטחתה בעדינות כשהיא פונה כלפי מטה על גיליון נוסף של נייר סטרילי. לאחר מכן, יש להוסיף לכל בארה 100 µL של alpha MEM מועשר ב-1% FBS.יש לבדוק כל דגימה בארבע עמודות סמיכות. באותה פלטה, יש להעביר מאה µL לכל באר של מנות (aliquots) המיועדות לבדיקה בשורה הראשונה. בדרך כלל, מזריעים תאים רגישים עם דילול לוגריתמי סדרתי של הדגימות המודבקות.לביצוע פעולה זו, הוסף שוב 11 µL של אותה דגימה לכל באער בארבעה באערים. כעת, בשורה השנייה של פלטת 96 הבאערים, ערבב באמצעות פיפט רב-ערוצי על ידי שאיבה ופליטה של הנוזל שלוש פעמים, והעבר 11 µL מכל באער לשורה השלישית, וכן הלאה עד לשורה האחרונה של הפלטה. לאחר ה הדבקת התאים, הדגר את הפלטות בתא לחות בטמפרטורה של 33 °C עם 5%CO2 עבור קורונה וירוס אנושי.מדביקים 2290 תאים ומדגירים אותם למשך חמישה ימים, ואילו תאים שהודבקו ב-human coronavirus OC 43 מדגירים למשך ארבעה ימים. לאחר פרק זמן זה ניתן להמשיך לגילוי הנגיף.לאחר הדגירה, אנו מוכנים לזיהוי הנגיף. ראשית, נסיר את המצע לחלוטין. אנו מבצעים זאת על ידי ניעור של הצלחות אל תוך מגבות נייר שאינן סטריליות בתוך מ त्यौב זרימה למינרית.לאחר מכן, נשטוף בעדינות את התאים על ידי מילוי הריבועונים ב-PBS באופן עדין. נשתמש בפיפט רב-ערוצי. ננער את ה-PBS מתוך הריבועונים ונסיר שאריות PBS על ידי עטיפת כל פלטה בנייר סופג.לאחר שטיפת התאים, יש לקבע אותם באמצעות מתנול בריכוז 100% המכיל 0.3% hydrogen peroxide. יש להוסיף את תערובת המתנול לתאים ולהמתין 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ד incubaton של 30 דקות, מסירים את חומר הקיבוע על ידי ניעור המצעים מעל הכיור. שאריות של חומר הקיבוע מוסרות על ידי ניעור המצעים כשהם פונים כלפי מטה על גבי מספר מגבות נייר שהונחו על משטח העבודה.לאחר מכן, הניחו לדגימה להתייבש לחלוטין באוויר, כאשר הפנים פונה כלפי מעלה, למשך כ-15 עד 30 דקות בזמן שהתאים מתייבשים. ניתן להכין תמיסת נוגדנים ספציפית לנגיף בדילול המתאים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של הנוגדן הנגיפי הספציפי לכל באר בלוחות האינקובציה והדגירו למשך שעתיים ב-37 °C.לאחר הדגירה, הסירו את המצע לחלוטין על ידי נעירה של הפלטה מעל הכיור. שטפו את הפלטה על ידי מילוי הבארים ב-PBS. לאחר מכן, נערו את הפלטה לתוך הכיור ושטפו שוב עם PBS.חזרו על הפעולה פעמיים נוספות. הסירו את כל שאריות ה-PBS על ידי נקישה של הבארות כשהן פונות כלפי מטה על נייר סופג לא סטרילי המונח על משטח העבודה. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 100 µL של נוגדן משני בדילול של 1:1000.דילול ב-PBS, דגירה של הפלטה למשך שעתיים ב-37 degrees ללא CO2, ו-30 דקות לפני סיום הדגירה יש להכין את ריאגנט הגילוי, שהוא תערובת של DAB עם PBS ו-0.01% hydrogen peroxide. שטפו את הפלטה שלוש פעמים ב-PBS כפי שבוצע קודם לכן.לאחר שטיפת הפלטה, הוסף 100 µL של ריאגנט פיתוח לכל באר. הדגר למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר או עד לצביעת הביקורת החיובית. כדי לעצור את התגובה, שטוף את הפלטה פעם אחת במים כפי שבוצע בעבר עם PBS ומלא כל באר ב-100 µL של מים דאיוניים.לבסוף, קראו את הפלטות באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לכמת את כל הבארים המציגות תאים צבועים. כעת, לאחר זמן רב, נוכל לקבוע את הטיטר של הנגיף שלנו. ניתן לחשב זאת באמצעות שיטת car, שהמשוואה עבורה מופיעה בפרוטוקול של Springer המלווה סרטון זה.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע טיטרציה של קורונה-וירוסים אנושיים בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור שאתם עובדים עם דגימות המכילות את שני הנגיפים וכי עליכם לעבוד בתנאים סטריליים. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

titration-of-human-coronaviruses-using-an-immunoperoxidase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

מקור: Bouillier, C., ועמיתיהם יצירה, הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)הסרטון מדגים בדיקת טיטרציה של פלאקים (plaque titration assay) המשמשת לכימות של נגיף סינציטנלי נשימתי (RSV) רקומביננטי זיהומי בשכבות מונו-שכבה של תאי אפיתל. הוא מציג את הדבקת תאי המאכסן באמצעות תרחיפי נגיף בדילולים סדרתיים, את הגבלת התפשטות הנגיף על ידי שכבת כיסוי חצי-מוצקה מבוססת תאית, ואת היווצרות פלאקים מקומיים כתוצאה מאפקטים ציטופתיים. הפרוצדורה מסתיימת בצביעה, דה-קונטמינציה...

בדיקת טיטרציה של פלאקים לכימות של נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV) זיהומי

סרטון זה מדגים בדיקות מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים באמצעות תאי כליות כלבים Madin-Darby המבטאים יתר על המידה חומצה סיאלית מקושרת α2,6 בסרה. בדיקה זו משמשת לעתים קרובות עבור סרולוגיה אנושית...

בדיקת מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים בסרום אנושי

סרטון זה מציג בדיקת נטרול המודדת את יעילות הסרום בנטרול נגיפי SARS-CoV-2. הוא כולל וירוסים פסאודוטייפים, דילול בסרום וכימות מבוסס לומינסנציה, החושף את טיטר הניטרול.

הערכת נוגדנים מנטרלים פונקציונליים של SARS-CoV-2

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

פרוטוקול זה מציג גישה מדויקת ואובייקטיבית לדמיין טיטריוציות ויראליות באמצעות סגול קריסטל, על ידי השוואתו עם מיקרוסקופיה אופטית וכתמים אימונוציטוכימיים.

שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays

וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פסאודו-וירוס היברידי חדשני מסוג אלפא-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) כפלטפורמה לכימות מהיר של הדבקה של וריאנטים של SARS-CoV-2 ורגישותם לנוגדנים מנטרלים.

יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

למדו שיטת טיטרציה לנגיפי קורונה האדם באמצעות Assay אימונופרוקסידאזה. פרוטוקול זה מציע חלופה אמינה לשיטות plaque assay לווירוסים ללא השפעות ציטופתיות.

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

גלה סרטונים נוספים