הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה
9 ביולי 2008
מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.
הכנת תאים דנדריטיים ממח העצם מספקת מקור מצוין לתאים המציגים אנטיגן שניתן להשתמש בהם לניסויים במבחנה או in vivo בשתי הדמיות בוטון של מערכת החיסון. הכנסת תאים מציגי אנטיגן מאפשרת לחקור אינטראקציות בין תאים ספציפיים לאנטיגן בהקשר של בלוטת הלימפה החיה. כאן אנו מדגימים את הבידוד הסטרילי של מח עצם וטכניקות תרבית לייצור תאים דנדריטיים בוגרים.
יתר על כן, אנו עוקבים אחר התפתחות תאים דנדריטיים מהיום הראשון ועד היום ה-11. פיתוח זה מתואר בתמונות סטילס ובסרטוני חממה שנעשו באמצעות טכנולוגיות ריח באתר incus. לבסוף, אנו מראים תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם המציגים אנטיגן מפרץ לשני תאי T OT בבלוטת הלימפה המשקפת.
היי, אני מלאני מתיו במעבדה של מיכה הלן באוניברסיטת קליפורניה הסמוכה. האם אי פעם תהיתם מה קורה בפנים במהלך הבדיקה בזמן שהתאים שלכם גדלים? היום?
כחלק מהפרוטוקול שלנו, אנו הולכים להראות לך כיצד להשתמש ב-S בחלק מהמכשירים באתר. האתר הדיו מאפשר לך לעקוב אחר צמיחת תרבית התאים בחממה שלך. בפרוטוקול זה, אנו הולכים להראות לך כיצד לבודד ולהכין תאים שמקורם במח עצם ולקבץ תאים מעכבר.
אז הדבר הראשון שאני הולך להראות לך איך לעשות הוא להסיר את עצמות הירך ולבודד את מח העצם תחילה להצמיד את החיה. לאחר מכן, הרטיבו את החיה באתנול 70%. בצע את החתך הראשון לאורך קו האמצע של החיה.
ואז חתכו בתוך הרגל כפי שאני מראה לכם כאן. כדי לחשוף את רקמת השריר מעל עצם הירך, אתה אמור להיות מסוגל למשוך הצידה את השריר ולתפוס את עצם הירך הגדולה בעזרת פינצטה הדיסקציה שלך. כשאתה מחזיק את העצם עם פינצטת החיתוך שלך, זז במורד העצם ובצע את החתך הראשון שלך ממש מתחת למפרק.
לאחר מכן עבדו את המספריים לאורך עצם הירך וגרמו לו לחתוך קרוב ככל האפשר לגוף. זה עלול לגרום למעט דם, במיוחד אם חותכים את עורק הירך. כאשר אתה מסיר את עצם הירך, חשוב ביותר שהעצם תישמר שלמה.
כפי שניתן לראות כאן בקצות העצם לא נחתכו או שובשו. לאחר הסרת עצם הירך, גזרו כל רקמה נוספת והניחו את עצם הירך בצלחת קטנה של אמצעי ה-PMI שלנו. בעת הסרת רקמה נוספת, וודאו שעצם הירך לא מתייבשת.
בשלב זה, יש להעביר את עצמות הירך לכלי המכיל 70% אתנול ולהניח על קרח למשך חמש עד 10 דקות. לצורך סרטון זה, נמשיך על ספסל המעבדה. עם זאת, בשלב זה של הניסוי, יש להעביר הכל למכסה המנוע של תרבית רקמות.
לאחר שהעצמות הושרו באתנול, תוכלו להעביר אותן לצלחת גדולה יותר של מדיה סטרילית להסרת מח העצם. כעת אנו מוכנים להסיר ולהשעות מחדש את מח העצם. מלאו מזרק אינסולין בחומר סטרילי והניחו בצד לשימוש מאוחר יותר.
אחוז בעצם עם הפינצטה הסטרילית שלך. החזיקו אותו מעל צלחת קטנה לחתיכות שהושלכו וחתכו את האפיפיזה או את קצות העצם מכל צד. הנח את מזרק האינסולין שלך בצד אחד של העצם ושטוף את המח החוצה מהעצם ל-15 מיל מדיה.
שטפו את העצם פעם או פעמיים נוספות עד שכל מח העצם נשטף החוצה. ברגע שהמח נשטף מהעצם, הוא יהיה לבן כמעט לחלוטין. מניחים את העצם הנקייה לתוך צלחת השלכה וחוזרים על התהליך של עצם הירך השנייה.
לאחר השלמת המשימה, יש לשבש בעדינות את כל חלקי המח שלא נשברו בתהליך הכביסה כדי ליצור תרחיף תא יחיד. זה ייקח חמש עד 10 דקות של פיפטינג. הניחו מתלה תא בודד בצינור חרוטי של 50 מיל, שטפו את הצלחת לפחות שלוש פעמים עם 10 מיל מדיה.
בכל פעם, סובב את התאים, הסר את המדיה והשהה מחדש את התאים על ידי הברשה חזקה ומהירה של האצבעות בתחתית הצינור. כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות או תאי הדם האדומים, אנו מבצעים ליזה של מים. שיטה נוספת להסרת כדוריות דם אדומות היא ליזה של אמוניום כלוריד.
שתי השיטות תוארו במאמרי וידאו קודמים של JoVE. בידוד של CD ארבעה תאי T חיוביים מבלוטות לימפה של עכבר באמצעות טיהור מקסימלי של מילאנו JoVE גיליון תשע והכנת גורם גדילה של תאי T מציטי חולדות JoVE. גיליון 10.
לאחר הסרת ה-RBCs שלכם, אתם מוכנים כעת לתרבית את עצמכם. אז לפני שאני לוקח אתכם דרך תרבית תאי דנדרי, אני רוצה להציג בפניכם את אתר האינקוס. אתר האינקוס יאפשר להפחית, לחזות צמיחת תרבית תאים בתוך החממה, כך שנוכל לצפות בעצמנו כיצד הם מתנהגים או מתנהגים בצורה לא נכונה.
לאחר הגדרת תרבית, אתה מניח אותה במגש בגודל המתאים וסוגר את אתר האינקוס. ואז במחשב שלך, אתה פשוט מגדיר את מרווח הזמן ואז בוחר את הבארות שתרצה תמונה ונותן לאתר הדיו לאסוף עבורך נתונים. הסרטים יראו לך בפרוטוקול זה, להדגים שינויים במורפולוגיה של תאים דנדריטיים במבחנה.
סרטונים אלה יוצאו ישירות מתוכנית האתר של אינקוס. כאשר התאים הדנדריטים מתפתחים מהיום הראשון עד היום ה-11, אתה יכול לראות שינוי מורפולוגיה אמיתי כשהם גדלים ומקבלים את פנוטיפ התא הדנדריטי. לאחר ליזה, RBCs והסרתם, התאים נשטפים במדיה תאית דנדריטית ראשונית ומצופים ב-5 מיליון למיל.
תאים אלה צריכים להיות מתורבתים בתחילה במצע תרבית תאים דנדריטי ראשוני, ובהמשך אנו מגדלים אותם במדיה DC משנית, המתווספת ל-40 ננוגרם למיל IL ארבעה ומאה ננוגרם למיל-TNF אלפא. ציטוקינים אלה יסייעו בהתפתחות תאים דנדריטיים בוגרים הדומים לתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים. אז עכשיו אני הולך להראות לכם איך נראות התרבויות כשהן מתפתחות ואיך לשמר אותן לאורך זמן.
לאחר שציפית את התאים, אתה יכול לתרבית את התאים הדנדריטים במשך 72 שעות לפני שינוי המדיה הראשון שלך. כך תיראה התרבית הטיפוסית שלך מיד לאחר שתצליח את התאים ביום הראשון. והנה מבט על התאים.
ביום השלישי, אתם יכולים לראות שהתאים התחילו להיצמד לצלחת אך לא אימצו את הפנוטיפ הקלאסי של התא הדנדריטי. ביום הרביעי, הסר את המדיה והוסף 10 מיל של שאיפה חדשה של תקשורת DC ראשונית של התקשורת. ביום הרביעי, נסיר לימפוציטים בכל תא אחר שאינו נדבק.
עכשיו אתם יכולים להחזיר את עצמכם לאינקובטור לעוד שלושה ימים, שבעה ימים לאחר הציפוי הראשוני שלכם. כך תיראה התרבות הטיפוסית שלך. אתה יכול לדעת שהגיע הזמן לפצל את התאים ולדחות אותם.
ביום השביעי, התאים הדנדריטים מוסרים מהצלחת על ידי שאיבת המדיה ולאחר מכן הוספת EDTA סטרילי של 300 מילי-מולרית ודגירה למשך חמש דקות. לאחר מכן שוטפים את הצלחת שוב ושוב על ידי החזקה בזווית של 45 מעלות ופיפטינג של תמיסת ה-EDTA על גב הצלחת. זה נעשה במשך מספר דקות כדי להבטיח שתסיר את כל התאים הדנדריטים הדבקים.
התאים נאספים בצינור חרוטי של 50 מילי, ונשטפים פעמיים באמצעי DC משני. לאחר מכן התאים מושעים מחדש ומצופים ב-5 מיליון תאים לצלחת. תאים דנדריטיים טריים ביום השביעי מתיישבים במהירות בתחתית הצלחת, נדבקים ומתחילים להתפשט.
כפי שניתן לראות כאן בסרטון של אתר זיכי, סרטון זה צולם בחממה במהלך יומיים כדי להראות לכם את התפתחות התאים הדנדריטים מהציפוי הראשוני שנעשה ביום השביעי ועד תחילת היום התשיעי. ניתן להפעיל תאים דנדריטיים מורפולוגיה בדופק אנטיגן על ידי הוספת שני מיקרוגרם לכל LLPS כאן עם מאה מיקרוגרם לביציות לשימוש עם תאי T מטוהרים משני עכברים OT, שיש להם CD ספציפי לביציות ארבעה תאי T חיוביים. אם אתה משתמש באנטיגן אחר, חשוב לוודא שאתה משתמש בריכוז אופטימלי של אנטיגן כדי לדפוק את ה-dcs שלך כאן, ה-OV וה-LPS מתווספים למדיה ראשונית כך שהריכוז הסופי של LPS יהיה שני מיקרוגרם למיל ב-20 מיל, ו-OVA יהיה מאה מיקרוגרם למיל ב-20 מיל.
הנה תמונה של איך נראית תרבית טיפוסית של תאים דנדריטיים ביום 10. אתם יכולים לראות בתמונה הזו שהמורפולוגיה אופיינית מאוד לתא המציג אנטיגן. עליך תמיד לבדוק את אחוז התאים הדנדריטיים החיוביים ל-CD 11 C בפקס.
זאת כדי להבטיח שיש לך תרבית טהורה יחסית של תאים דנדריטיים לשימוש בניסויים שלך. כאן אנו משתמשים באתר הדיו ממכשירי SEN כדי לנטר את ההפעלה של תאים דנדריטיים שטופלו ב-LPS באנטיגן פועם ביום 10. סרטון זה משתרע על פני תקופה של 24 שעות מיד לאחר הוספת LPS וה-val והפפטיד, ובו תאים דנדריטיים הופכים פעילים יותר ויש כמה שינויים מורפולוגיים ברורים.
לאחר שהתאים הדנדריטים שלך הופעלו בדופק אנטיגן, אתה יכול לאסוף אותם שוב על ידי דגירה עם EDTA של 300 מילי-מולרית ושטיפת הצלחת. כעת סובב את התאים שלך כלפי מטה, שטוף פעמיים עם 50 מיל של מדיה RPMI כדי להסיר כל אנטיגן נוסף וסמן אותם בצבע מעקב התאים המתאים. בניסוי הזה אני אבצע הדמיה של התאים בבלוטת הלימפה המפשעתית.
נצטרך להזריק 2 עד 5 מיליון תאים דנדריטיים לתוך אזור האגף של העכבר שמוצג כאן. לאחר מכן אנו מאפשרים לתאים הדנדריטים 24 שעות לגור בבלוטת הלימפה המתאמנת. כאן בסרטון זה, תאים דנדריטיים מסומנים ב-CMF two hc, צבע מעקב אחר תאים כחולים.
אתה יכול לראות את התאים הדנדריטים מקיימים אינטראקציה עם תאי T מסומנים שהם אנטיגן ספציפי לוולין. תאי T אלה מסומנים ב-ccf SE. אתה יכול גם להשתמש ב-C-M-T-M-R או בכל אחד מצבעי מעקב התאים האחרים עבור בדיקות מולקולריות. זהו שלב ההפעלה המוקדם של תאי T המקיימים אינטראקציה עם dcs.
מכיוון שהם ספציפיים לאנטיגן, אתה יכול לראות שתאי ה-T נדבקים לקנוקנות של ה-dcs המסומנים בכחול. זה מסכם את הפרוטוקול שלנו המדגים את ההכנה והשימוש בתאים דנדריטיים של מח עצם שמקורם בעכבר בניסוי הדמיה של שני בוטונים. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את ההכנה והגידול של תאים דנדריטיים ממחית עצם, החיוניים להצגת אנטיגן במערכת החיסון. המחקר מדגיש את פיתוחם של תאים אלו ואת תפקידם בהפעלת תאי T באמצעות דימיון דו-פוטוני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של תאים דנדריטיים
- טכניקות דימות דו-פוטוני
רקע
- תאי דנדריטיים הם תאים קריטיים להצגת אנטיגן בתגובה החיסונית.
- ניתן לתרבות תאים דנדריטיים שמקורם במחול השומן למגוון יישומים ניסיוניים.
- הבנת האינטראקציות התאיות בקשריים לימפטיים היא חיונית למחקר אימונולוגי.
- דימוי דו-פוטוני מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות חיסוניות.
מטרת המחקר
- בידוד והתרבית של תאי דנדריטים בוגרים ממח העצם.
- הדמיה של אינטראקציות ספציפיות לאנטיגן בתוך קשרי לימפה חיים.
- מתן פרוטוקול מפורט להכנה והדמיה של תאי דנדריטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי מחית עצם תחת תנאים סטריליים.
- טכניקות תרבית להבשלת תאים דנדריטיים.
- דימוי דו-פוטוני לצפייה באינטראקציות של תאים דנדריטיים.
- דימוי במרווחי זמן (Time-lapse) לתיעוד התפתחות תאים דנדריטיים.
תוצאים עיקריים
- תרבית מוצלחת של תאים דנדריטיים בוגרים ממוח העצם.
- ויזואליזציה של תאים דנדריטיים המציגים אנטיגנים לתאי T.
- תיעוד התפתחותם של תאים דנדריטיים לאורך תקופה של 11 ימים.
- הדגמת התועלת של דימות דו-פוטוני בחקר תגובות חיסוניות.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה להכנת תאים דנדריטיים.
- דימיון דו-פוטוני יעיל לצפייה באינטראקציות חיסוניות.
- הבנת התפקוד של תאים דנדריטיים היא קריטית לקידום המחקר האימונולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הפקה מהימנה של תאים דנדריטיים עכבריים המופקים ממוח העצם מאפשרת מידול ברמת דיוק גבוהה של הצגת אנטיגן והפעלה של תאי T במחקר אימונולוגי פרה-קליני. דימוי בשני פוטונים של תאים אלו בקשרי לימפה מספק תובנה מכניסטית לגבי אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון, ובכך תומך בביטחון תחזורי בשלבי גילוי מוקדמים ותיקוף מטרות. זרימת עבודה זו מהווה בסיס לרצף תרגומי עבור קבלת החלטות בpipeline של טיפולים אימונותרפיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בירור מכניסטי של הצגת אנטיגנים והפעלת תאי T במערכת מבוקרת הרלוונטית למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תפקוד תאי דנדריטיים ושלבי האינטראקציה שלהם עם תאי T.
- מסייע בביסוס ביטחון חזוי בבחירה ובתיקוף של יעדים חיסוניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מקור סטנדרטי של תאי דנדריטיים בוגרים בעלי ביטוי גבוה של CD11c, לצורך בדיקות הניתנות לשחזור in vitro ו-in vivo.
- מאפשר מעקב כמותי אחר הבשלה והפעלה של תאים דנדריטיים באמצעות פלטפורמות של דימוי תאים חיים (live-cell imaging).
- תומך במוכנות של הבדיקה להערכת תגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן והשפעות של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים חיסוניים הרלוונטיים למחלה על ידי מידול של הצגת אנטיגן בקשרי לימפה פריפריים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של אסטרטגיות למודולציה חיסונית.
- מספק פלטפורמה לקידום מועמדים ממוקדי-חיסון תוך התאמה לסיכונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת תאים מציגים של אנטיגן (antigen-presenting cells) שעברו תיקוף עבור מחקרים מכניסטיים ומדידות מבוססות דימיון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולי הצגת אנטיגן והפעלת תאי T.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור על הבשלה ותפקוד של תאים דנדריטיים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של פנוטיפ תאי, שלבי אינטראקציה ותגובות ספציפיות לאנטיגן.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro לבין דינמיקה חיסונית in vivo בקשרי לימפה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר להכנה ודימוי של תאי מערכת החיסון על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מנגנונים חיסוניים ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מסמך את הכנת התאים הדנדריטיים והדימיון לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי הפחתת עמימות מנגנונית במידול תגובה חיסונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאימונותרפיה בהסתמך על נתונים מנגנוניים חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד סטרילי של תאים, תרבית תאים וציטומטריה של זרימה להערכת טוהר התאים.
- נדרשת גישה לפלטפורמות של דימוי תאים חיים ומיקרוסקופיה דו-פוטונית למחקרים דינמיים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת תאים ודחיסת אנטיגנים (antigen pulsing).
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור אנטיגנים שונים או סגוליות של קולטני T cell.
- תלוי בסממנים מתוקפים (למשל, CD11c) ובתוצרי דימוי כמותיים לצורך בקרת איכות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:42
Bone marrow isolation and resuspension: Removing the femur
3:32
Removal and re-suspension of the bone marrow.
6:21
Incucyte
7:32
Culturing of dendritic cells
11:26
Collection of activated, antigen pulsed dendritic cells, intra dermal injection, and 2-photon imaging
12:47
Conclusion
