הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

הכנת תאי דנדריטיים ממח העצם מספקת מקור מצוין של תאים מציגי אנטיגן שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים in vitro או in vivo בדימות דו-פוטוני של מערכת החיסון. הכנסת תאים מציגי אנטיגן מאפשרת את חקר האינטראקציות בין תאים הספציפיות לאנטיגן בהקשר של קשרי לימפה חיים. כאן אנו מדגימים את הבידוד הסטרילי של מח העצם וטכניקות תרבית לייצור של תאים דנדריטיים בוגרים.

בנוסף, אנו עוקבים אחר התפתחות תאי דנדריטיים מהיום הראשון ועד היום ה-11. התפתחות זו מוצגת באמצעות תמונות סטטיות ובסרטוני דגירה שהוכנו באמצעות אתר ה-incus של scent technologies. לבסוף, אנו מראים תאים דנדריטיים המופקים ממחית גרמי עצם המציגים אנטיגן cove לתאי T מסוג OT two בקשרית הלימפה התואמת.

שלום, אני מלאני מתיו מהמעבדה של מייקה האלן באוניברסיטת קליפורניה הסמויה. האם תהיתם פעם מה קורה בפנים במהלך התהליך בזמן שתאיכם גדלים? היום?

כחלק מהפרוטוקול שלנו, נראה לכם כיצד להשתמש במספר מכשירים במערכת. מערכת inky מאפשרת לעקוב אחר צמיחת תרביות תאים באינקובטור שלכם. בפרוטוקול זה, נראה לכם כיצד לבודד ולהכין תאי דנדריטיים המופקים ממחית גרמיים של עכבר.

הדבר הראשון שאראה לכם כיצד לבצע הוא הסרה של עצמות הירך ובידוד של מח עצם. ראשית, קבעו את בעל החיים באמצעות סיכות. לאחר מכן, הרטיבו את בעל החיים ב-70% ethanol. בצעו את החתך הראשון לאורך קו האמצע של בעל החיים.

לאחר מכן, גזרו בחלק הפנימי של הרגל כפי שאני מראה לכם כאן. כדי לחשוף את רקמת השריר מעל ה-femur, עליכם להיות מסוגלים להזיז את השריר הצידה ולאחוז בעצם ה-femur הגדולה בעזרת פינצטת הניתוח. בזמן שאתם מחזיקים את העצם עם פינצטת הניתוח, רדו במורד העצם ובצעו את החתך הראשון ממש מתחת למפרק.

לאחר מכן, הניעו את המספריים לאורך הירך וגזרו קרוב ככל האפשר לגוף. פעולה זו עשויה לגרום לדימום קל, במיוחד אם נגזז את העורק הירך (femoral artery). בעת הוצאת הירך, חשוב ביותר לשמור על שלמות העצם.

כפי שניתן לראות כאן, קצוות העצם לא נחתכו או נפגעו. לאחר הסרת הפמור, גזרו כל רקמה עודפת והניחו את הפמור בתוך צלחת קטנה עם מצע ה-PMI שלנו. בעת הסרת רקמה עודפת, ודאו שעצם הפמור אינה מתייבשת.

בשלב זה, יש להעביר את עצמות הפמור למנה containing 70% ethanol ולהניחן על קרח למשך חמש עד 10 דקות. לצורך סרטון זה, נמשיך לעבוד על שולחן המעבדה. עם זאת, בשלב זה של הניסוי, יש להעביר את כל הפעולות למנדף תרביות רקמה.

לאחר שהעצמות הושרו באתנול, ניתן להעביר אותן לכלי גדול יותר המכיל מצע סטרילי לצורך הסרת מחית העצם. כעת ניתן להסיר ולהשעות את מחית העצם. מלאו מזרק אינסולין במצע סטרילי והניחו אותו בצד לשימוש מאוחר יותר.

תפוס את העצם באמצעות פינצטה סטרילית. החזק אותה מעל צלחת קטנה לשאריות גזורים וגזור את האפיפיזה או את קצוות העצם מכל צד. הכנס את מזרק האינסולין לצד אחד של העצם ושטוף את מחולץ העצם מתוך העצם לתוך 15 mils של מדיום.

שטפו את העצם פעם אחת או פעמיים נוספות עד שכל מחולק העצם יישטף החוצה. ברגע שכל מחולק העצם יישטף החוצה, העצם תהיה כמעט לבנה לחלוטין. העבירו את העצם הנקייה לכלי הפסולת וחזרו על התהליך עבור העצם הפמורית השנייה.

לאחר השלמת שלב זה, השתמש בפיפטה בעדינות כדי לפרק שאריות של מח עצם שלא נשברו במהלך תהליך השטיפה, במטרה ליצור תרחיף של תאים בודדים. פעולה זו תארך בין 5 ל-10 דקות של פיפטינג. העבר את תרחיף התאים הבודדים למבחנה קונית של 50 ml, ושטוף את הפלטה לפחות שלוש פעמים עם 10 ml של מדיום.

בכל פעם, סבבו את התאים במערבל צנטריפוגי (spin down), הסירו את המדיום והחזירו את התאים לסוספנזיה על ידי שפשוף נחרץ ומהיר של האצבעות בתחתית המבחנה. כדי להסיר את תאי הדם האדומים (RBCs), נבצע ליזיס באמצעות מים. שיטה נוספת להסרת תאי דם אדומים היא ליזיס באמצעות אמון חלוריד.

שתי השיטות תוארו במאמרי וידאו קודמים של JoVE. בידוד תאי T חיוביים ל-CD4 מקשרי לימפה של עכבר באמצעות ה-MACS purification (JoVE issue 9) והכנת גורם גדילה לתאי T מצ'יטות של חולדה (JoVE issue 10).

לאחר הסרת תאי הדם האדומים (RBCs), אתם מוכנים כעת לתרבית. לכן, לפני שאני מדריך אתכם בתרבית תאי דנדריטיים, אני רוצה להכיר לכם את אתר ה-incucyte. אתר ה-incucyte יאפשר מעקב וניבוי של צמיחת תרביות תאים בתוך האינקובטור, כך שנוכל לצפות בתאים ולראות כיצד הם מתנהגים או אינם מתנהגים.

לאחר הקמת התרבית, מקריבים אותה במגש בגודל המתאים ומגליסים לסגירה את אתר ה-incus. לאחר מכן, במחשב, מגדירים פשוט את מרווחי הזמן, בוחרים את הבארים שברצונכם לצלם ומשאירים את אתר ה-inky לאסוף עבורכם את הנתונים. הסרטונים בפרוטוקול זה ידגימו שינויים במורפולוגיה של תאי דנדריטיים in vitro.

סרטונים אלו יוצאו ישירות מתוכנת אתר ה-Incus. ככל שתאי הדנדריטים מתפתחים מהיום הראשון עד היום ה-11, ניתן לראות שינוי מורפולוגי ממשי בעודם גדלים ומאמצים את הפנוטיפ של תאי דנדריטים. לאחר ליזיס והסרה של RBCs, התאים נשטפים במצע גידול לתאי דנדריטים ראשוניים ומונחים בצלחות בריכוז של 5 מיליון למיליליטר.

יש לתרבת תאים אלו תחילה במצע תרבית לתאי דנדריטיים ראשוניים, ומאוחר יותר נתרבת אותם במצע DC משני, המועשר ב-40 ng/ml IL-4 וב-100 ng/mL TNF-α. ציטוקינים אלו יסייעו בפיתוח תאים דנדריטיים בשלים הדומים לתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים. כעת אראה לכם כיצד נראות התרביות במהלך התפתחותן וכיצד לתחזק אותן לאורך זמן.

לאחר שזרעתם את התאים, ניתן לגדל את התאים הדנדריטיים למשך 72 שעות לפני החלפת המדיום הראשונה. כך תיראה תרבית טיפוסית מיד לאחר זריעת התאים ביום הראשון. וכאן ניתן לראות מבט מקרוב על התאים.

ביום השלישי, ניתן לראות שהתאים החלו להיצמד לפיתח אך טרם אימצו את הפנוטיפ הקלאסי של תאי דנדריטיים. ביום הרביעי, יש להסיר את המצע ולהוסיף 10 mils של מצע טרי לתרבית תאי DC ראשוניים באמצעות שאיבה של המצע. ביום הרביעי, נסיר את הלימפוציטים וכל תא אחר שאינו נצמד.

כעת ניתן להחזיר את התרביות לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים, שבעה ימים לאחר הזריעה הראשונית. כך תיראה תרבית טיפוסית. ניתן לזהות כי הגיע הזמן לפיצול התאים ולהעברתם לכלי חדש.

ביום השביעי, מסירים את התאים הדנדריטיים מהפלטה על ידי שאיבת המצע, ולאחר מכן מוסיפים EDTA סטרילי בריכוז 300 millimolar ומדגירים למשך חמש דקות. לאחר מכן, שוטפים את הפלטה שוב ושוב תוך החזקתה בזווית של 45 מעלות והעברת תמיסת ה-EDTA באמצעות פיפט אל גב הפלטה. פעולה זו תבוצע במשך מספר דקות כדי להבטיח את הסרתם של כל התאים הדנדריטיים הדבקים.

אוספים את התאים לשפופרת קונית של 50 ml ושוטפים אותם פעמיים עם מצע DC משני. לאחר מכן, התאים סספנדים מחדש ונזרעים בריכוז של 5 מיליון תאים לצלחת. תאי דנדריטיים מיום שבע שסורגבו מחדש שוקעים במהירות לתחתית הצלחת, נצמדים ומתחילים להיפרש.

כפי שניתן לראות כאן בסרטון מאתר Zichy, סרטון זה צולם בתוך האינקובטור לאורך יומיים כדי להראות את התפתחות התאים הדנדריטיים, מהריplating הראשוני שבוצע ביום השביעי ועד תחילת היום התשעי. ניתן להפעיל תאים דנדריטיים מורפולוגיים באמצעות פולס של אנטיגן על ידי הוספת 2 µg/mL של LPS, יחד עם 100 µg של ova לשימוש עם T-cells שסוננו מעכברי OT-II, להם T-cells חיוביים ל-CD4 ספציפיים ל-ova. אם אתם משתמשים באנטיגן אחר, חשוב לוודא שאתם משתמשים בריכוז אופטימלי של אנטיגן עבור הפולס של התאים הדנדריטיים. כאן, ה-ova וה-LPS מתווספים למצע ראשוני כך שהריכוז הסופי של LPS יהיה 2 µg/mL ב-20 mL, וה-ova יהיה 100 µg/mL ב-20 mL.

הנה תמונה של תרבית טיפוסית של תאים דנדריטיים ביום ה-10. ניתן לראות בתמונה זו כי המורפולוגיה אופיינית מאוד לתא מציג אנטיגן. תמיד יש לבדוק את אחוז התאים הדנדריטיים החיוביים ל-CD 11 C באמצעות fax.

זאת כדי להבטיח שתהיה בידיכם תרבית טהורה יחסית של תאים דנדריטיים לשימוש בניסויים שלכם. כאן אנו משתמשים ב-IncuCyte של SEN instruments כדי לנטר את האקטיבציה של תאים דנדריטיים שטופלו ב-LPS וקיבלו פעימה של אנטיגן ביום ה-10. סרטון זה חולש על תקופה של 24 שעות מיד לאחר הוספת ה-LPS והפפטיד, ובמהלכו התאים הדנדריטיים הופכים לפעילים יותר וישנם שינויים מורפולוגיים ברורים.

לאחר שהתאים הדנדריטיים הופעלו במהלך דחף האנטיגן, ניתן לאסוף אותם שוב על ידי דגירה עם 300 millimolar EDTA ושטיפת הפלטה. כעת, יש לסובב את התאים במ centriuge, לשטוף פעמיים עם 50 mils של מצע RPMI כדי להסיר אנטיגן עודף, ולסמן אותם בצבע cell tracker המתאים. בניסוי זה, אבצע הדמיה של התאים בקשריה הלימפטיקה המפשעת.

יהיה עלינו להזריק בין שניים לחמישה מיליוני תאי דנדריטים תת-עורית לאזור השפשפת של העכבר המוצג כאן. לאחר מכן נמתין 24 שעות כדי לאפשר לתאי הדנדריטים להגיע לקשרי הלימפה המיועדים. בסרטון זה, תאי הדנדריטים מסומנים באמצעות CMF two hc, צבע מעקב תאי כחול.

ניתן לראות תאים דנדריטיים המקיימים אינטראקציה עם תאי T מסומנים, הספציפיים לאנטיגן של volin. תאי T אלו מסומנים באמצעות ccf SE. ניתן להשתמש גם ב-C-M-T-M-R או בכל אחד מצבעי ה-cell tracker האחרים כגששים מולקולריים. זהו שלב ההפעלה המוקדם של תאי T המקיימים אינטראקציה עם תאים דנדריטיים.

בשל העובדה שהם ספציפיים לאנטיגן, ניתן לראות שהתאי T נצמדים לזרועות של התאים הדנדריטיים המסומנים בכחול. בכך מסתיים הפרוטוקול שלנו המדגים את ההכנה והשימוש בתאים דנדריטיים ממחילת עצם של עכבר בניסוי דימוי בעל שני כפתורים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.