Name: הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: חקור את הכנת תאים דנדריטיים ממח עצם עכברים לצורך הדמיה בשני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות אנטיגן-תא T בבלוטות הלימפה החיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

National Institutes of Health אחווה אחוות Kirchstein predoctoral AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (IP)

1) הסר את שתי עצמות הירך של העכבר one <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לנתיחה כדי לחתוך שרירים לחשוף את עצם הירך מעל ומתחת המפרקים (הברך הירך). אחוז במרכז של עצם הירך עם פינצטה לנתיחה לחתוך מעל ומתחת המפרקים לעזוב כמה שיותר epiphysis ללא פגע ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כמו שריר רבה ככל האפשר באמצעות מספריים קטנים לנתיחה. מעבירים את עצם הירך לתוך צלחת של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנהלים צריכים להתבצע בשכונה מנקודה זו ואילך, רק באמצעות התקשורת סטרילית, מכשירים, טיפים פיפטה ומנות תרבות. </li></ol> 2) לעקר עצמות עצם הירך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, העברת עצמות מן RPMI לצלחת התרבות קטן מלא אתנול 70% על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג עצמות באתנול במשך 5 דקות על הקרח. </li></ol> 3) איסוף מוח העצם בתנאים סטריליים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עצמות לצלחת תרבות קטן המכיל סטרילי התקשורת סינון ראשוני DC תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה סטרילי, להחזיק את העצם מעל צלחת להשליך או צינור, ואת במספריים סטריליות, לחתוך כל epiphesis (קצות העצם) לדרך. לחתוך צריך לחשוף את מח העצם שהוא אדום בהיר במרכז העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק סטרילי (26-28 מחט מד), להתחנף כ 100-200 מ&quot;ל של התקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העצם עם פינצטה סטרילי מעל צלחת מתוקים של התקשורת סטרילי ולהכניס את המחט בצד אחד של העצם. מקם את קצה המחט ליד החלק העליון של עצם לאט לשטוף את העצם החוצה עם התקשורת סטרילית. אם אתה במרכז העצם, המחט צריכה להחליק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח העצם שוטף החוצה, לא חתיכות קטנות או מקשה אחת. זה צריך להיות סמוקות מתוך העצם לתוך כלי התקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו כנדרש לחלוטין לשטוף את מוח מתוך העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העצם הוא נקי, זה יהיה לבן שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נוהל זה עם עצם הירך אחרים. מחק כל עצם הירך לאחר שהוא נקי. </li></ol> 4) Re-Spin ו להשעות את מוח העצם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור בז סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מח עדיין לא נפגעו, בעדינות רבה פיפטה התקשורת מעלה ומטה בצלחת, כדי לשבור את מח לתוך ההשעיה תא בודד. זה עלול לקחת כמה דקות צריך להיעשות לאט, כדי למנוע הרג תאים על ידי כוח מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים כמו כל בתאי יונקים אחרים. </li></ol> 5) Cell תמוגה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך צנטריפוגה לאחר הספין נעשה ויוצקים את התקשורת (למזוג) לתוך פסולת קטן (50 מ&quot;ל צינור בז) בשכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ידי מצליף בעדינות את החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במים מסוננים סטרילית DPBS 10x 10x או PBS, לבצע תמוגה מים כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות (RBCs) באמצעות הכרכים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 מ&quot;ל מים מסוננים סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל או DPBS 10x 10x PBS </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל של 10x PBS 5-10 שניות לאחר הוספת המים. חשוב מאוד לעשות את זה מיד, כך שרק RBCs הם lysed. זה רעיון טוב שיש pipettes שניהם מלאים ומוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל - 10 מ&quot;ל של התקשורת DC סטרילי בסיסיים. </li></ol> 6) ספירת תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, לערבב 6-11 מ&quot;ל של תאים במח העצם על ידי בעדינות מתערבל הצינור עם היפוך קל, הטיה של 45 מעלות (לא כל כך שהתקשורת נוגע בחלק העליון של הצינור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 10 מ&quot;ל של מדיה לתוך צינור סטרילי עבור לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מכסה את התאים צנטריפוגות שוב. </li></ol> 7) תאים דנדריטים ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות של 1 x 106/mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים בצנטריפוגה, מדיה למזוג מחדש תאים להשעות את הסכום המתאים של ראשי מדיה DC עבור ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ברקמת התרבות בחממה. </li></ol> 8) טיפוח תרבות והתבגרות: תמיד לבדוק את התרבויות לפני הוספת התקשורת יותר או שימוש בניסויים כלשהו. בדוק את הבריאות הכללית של תאים לחפש זיהום פוטנציאליים. יום 0: תאים דנדריטים מצופה. יום 3: הסרת 75% של התקשורת ולא adherant תאים ולהוסיף ראשי חזרה מדיה DC. יום 6: לאחר ציפוי תא ראשוני: Re-צלחת התאים באמצעות ההליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה, אשר יכילו כמה אי - adherant DCs בנקודה זו, ומניחים צינור סטרילי בז 50 מ&quot;ל, עוזב צלחות מאוד רטוב מעט (אתה לא רוצה את התאים חסיד להתייבש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 mM EDTA ב PBS על כל צלחת ולאפשר לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזיקו את הצלחת בזווית של 45 מעלות בעדינות פיפטה התקשורת מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת בעדינות כדי לסלק אי - adherant תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EDTA / PBS צריך להיות תאים המעידים עבה נמצאים שנאספו בתחתיתצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמה דקות של זה, תערובת תאים ניתן להעביר את הצינור 50 בז מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין כל התאים לאחר ביצוע הליך זה עבור כל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן צלחת התאים בצפיפות של 1 x 10 ^ 6 לכל צלחת משני מדיה ב-DC החדש סטרילי 10 מנות תרבות ס&quot;מ. חזור תאים לרקמות תרבות חממה. </li></ol> יום 10-11 DCs בוגר מוכן להעמסה גירוי / אנטיגן. 9) גירוי תאים דנדריטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש LPS (lipopolyscaccharide) בשילוב עם הפפטיד הרצוי עבור הפעלה וטעינה פפטיד. בהתאם המקור של LPS, תנאי גירוי שונים יכולים לתת תוצאות טובות יותר. בנוסף, כמות הרצויה של הפפטיד להצגה DC צריך להיות מותאם. התנאים גירוי בפרוטוקול זה היו 100 נ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 100 LPS UG / mL OVA (ovalbumin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיגן טען / לטפל עם LPS עבור 18-24 שעות לפני הקציר / להשתמש. </li></ol> מדיה תאים דנדריטים: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה נא עיין בסעיף דיון לבדיקה של תנאים שונים התרבות תאים דנדריטים את הפנוטיפ הנובע תאים דנדריטים. תנאים אלה נועדו תרבות לייצר תאים דנדריטים בשלים כי במהירות הביתה ניקוז בלוטות הלימפה, 18-24 שעות לאחר ההזרקה תת עורית אנטיגן הנוכחית וביעילות. ראשי DC מדיה: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל IMDM (להסיר 55-60 מ&quot;ל עבור נפח סופי 500ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל חום מומת FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L-Gln, הריכוז הסופי של 2 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 IU / mL פניצילין ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (5 מ&quot;ל של פן IU / mL 10,000 ו -10,000 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות סטרפטוקוקוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 UM B-Me (14.3 M B-Me המניות, לדלל 1:100 במנדף כימי, להשתמש ul 35 לכל 100 מ&quot;ל מדיה ריכוז 50 מיקרו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20-30 ng / mL GM-CSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100-400 IU / mL IL-4 בערך 10-40 ng / mL </li></ul> התקשורת SecondaryDC עבור * התבגרות 100 ng / mL TNF-אלפא (להוסיף ראשי מדיה DC) * הערה: GM-CSF + IL-4 צריך לייצר תאים דנדריטים בשלים. באמצעות GM-CSF + IL4 (400 IU / ul) + TNF-אלפא (100 UG / mL) ייצרו תאים הדומים לתאים בוגרים מונוציטים הדנדריטים נגזר. תאים דנדריטיים בוגרים ידועים לא לקחת את אנטיגן בצורה יעילה ככל תאים דנדריטים בשלים ותרבויות ייתכן אנדוגני TNF-שפורסם מתאי סטרומה 4.

<ol><li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4%2B+T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li>
<li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li>
<li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture%2C+but+in+contrast+to+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%2C+without+inducing+their+functional+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li>
<li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signals+in+CD4%2B+T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li>
<li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
</ol>

התאים הדנדריטים הם המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית הסתגלות התא אנטיגן היעילה ביותר להציג מאופיינת עד כה. שיטות אדם העכבר תרבית תאים דנדריטים בספרות נבדלות בסוג של ציטוקינים להשתמש כדי להשפיע על התפתחות סוגים שונים של תאים דנדריטים. יש לציין, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha ו - IFN-gamma משמשות בשילובים שונים כדי לייצר בוגרת, בשלה, דלקתיות היציב כמו מח עצם Murine נגזר תאים דנדריטים במבחנה 3-7. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לייצור תאים דנדריטים Murine בוגרים המסוגלים ביות כדי ניקוז בלוט...

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

כמה שיטות להכנת תאים דנדריטים Murine ניתן למצוא בספרות. כאן, אנו מציגים שיטה המייצרת יותר מ 85% תאים דנדריטים CD11c גבוה תרבות הביתה הצומת לימפה ניקוז לאחר הזרקה תת עורית ו אנטיגן ספציפי לערמונית להציג לתאי T (ראה וידאו). בנוסף, אנו משתמשים מכשירים אסן Incucyte לעקוב אחר ההבשלה תאים דנדריטים, שם, ב 10 יום, את המורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני של תא בוגר הדנדריטים &lt;85% של תאים CD11chigh. המחקר של המצגת אנטיגן בבלוטות הלימפה הפריפריה על ידי 2-פוטון הדמיה עולה כי ישנם שלושה שלבים ברורים של תאים דנדריטים ואינטראקציה תא T 1, 2. שלב I מורכב הקשר בין ניעתי סדרתי קצר מאוד ספציפי אנטיגן בתאי T אנטיגן נושאת תאים דנדריטים 1, 2. השלב השני מתאפיין מגעים ממושכים בין תא-T ו אנטיגן ספציפי אנטיגן נושאות תאים דנדריטים 1, 2. ולבסוף, בשלב השלישי מאופיין בתאי T ניתוק מן התאים הדנדריטים, החזרת תנועתיות ומתחיל לחלק 1, 2. זוהי דוגמה אחת לסוג של אנטיגן ספציפי לערמונית אינטראקציות כי ניתן לנתח על ידי הדמיה שני הפוטונים של אנטיגן טעון תא גשש צבען שכותרתו תאים דנדריטים.

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

בספרות ניתן למצוא שיטות מספריות להכנת תאים דנדריטיים של עכברים. כאן, אנו מציגים שיטה המניבה למעלה מ-85%...

הכנת תאי דנדריטיים ממח העצם מספקת מקור מצוין של תאים מציגי אנטיגן שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים in vitro או in vivo בדימות דו-פוטוני של מערכת החיסון. הכנסת תאים מציגי אנטיגן מאפשרת את חקר האינטראקציות בין תאים הספציפיות לאנטיגן בהקשר של קשרי לימפה חיים. כאן אנו מדגימים את הבידוד הסטרילי של מח העצם וטכניקות תרבית לייצור של תאים דנדריטיים בוגרים.בנוסף, אנו עוקבים אחר התפתחות תאי דנדריטיים מהיום הראשון ועד היום ה-11. התפתחות זו מוצגת באמצעות תמונות סטטיות ובסרטוני דגירה שהוכנו באמצעות אתר ה-incus של scent technologies. לבסוף, אנו מראים תאים דנדריטיים המופקים ממחית גרמי עצם המציגים אנטיגן cove לתאי T מסוג OT two בקשרית הלימפה התואמת.שלום, אני מלאני מתיו מהמעבדה של מייקה האלן באוניברסיטת קליפורניה הסמויה. האם תהיתם פעם מה קורה בפנים במהלך התהליך בזמן שתאיכם גדלים? היום?כחלק מהפרוטוקול שלנו, נראה לכם כיצד להשתמש במספר מכשירים במערכת. מערכת inky מאפשרת לעקוב אחר צמיחת תרביות תאים באינקובטור שלכם. בפרוטוקול זה, נראה לכם כיצד לבודד ולהכין תאי דנדריטיים המופקים ממחית גרמיים של עכבר.הדבר הראשון שאראה לכם כיצד לבצע הוא הסרה של עצמות הירך ובידוד של מח עצם. ראשית, קבעו את בעל החיים באמצעות סיכות. לאחר מכן, הרטיבו את בעל החיים ב-70% ethanol. בצעו את החתך הראשון לאורך קו האמצע של בעל החיים.לאחר מכן, גזרו בחלק הפנימי של הרגל כפי שאני מראה לכם כאן. כדי לחשוף את רקמת השריר מעל ה-femur, עליכם להיות מסוגלים להזיז את השריר הצידה ולאחוז בעצם ה-femur הגדולה בעזרת פינצטת הניתוח. בזמן שאתם מחזיקים את העצם עם פינצטת הניתוח, רדו במורד העצם ובצעו את החתך הראשון ממש מתחת למפרק.לאחר מכן, הניעו את המספריים לאורך הירך וגזרו קרוב ככל האפשר לגוף. פעולה זו עשויה לגרום לדימום קל, במיוחד אם נגזז את העורק הירך (femoral artery). בעת הוצאת הירך, חשוב ביותר לשמור על שלמות העצם.כפי שניתן לראות כאן, קצוות העצם לא נחתכו או נפגעו. לאחר הסרת הפמור, גזרו כל רקמה עודפת והניחו את הפמור בתוך צלחת קטנה עם מצע ה-PMI שלנו. בעת הסרת רקמה עודפת, ודאו שעצם הפמור אינה מתייבשת.בשלב זה, יש להעביר את עצמות הפמור למנה containing 70% ethanol ולהניחן על קרח למשך חמש עד 10 דקות. לצורך סרטון זה, נמשיך לעבוד על שולחן המעבדה. עם זאת, בשלב זה של הניסוי, יש להעביר את כל הפעולות למנדף תרביות רקמה.לאחר שהעצמות הושרו באתנול, ניתן להעביר אותן לכלי גדול יותר המכיל מצע סטרילי לצורך הסרת מחית העצם. כעת ניתן להסיר ולהשעות את מחית העצם. מלאו מזרק אינסולין במצע סטרילי והניחו אותו בצד לשימוש מאוחר יותר.תפוס את העצם באמצעות פינצטה סטרילית. החזק אותה מעל צלחת קטנה לשאריות גזורים וגזור את האפיפיזה או את קצוות העצם מכל צד. הכנס את מזרק האינסולין לצד אחד של העצם ושטוף את מחולץ העצם מתוך העצם לתוך 15 mils של מדיום.שטפו את העצם פעם אחת או פעמיים נוספות עד שכל מחולק העצם יישטף החוצה. ברגע שכל מחולק העצם יישטף החוצה, העצם תהיה כמעט לבנה לחלוטין. העבירו את העצם הנקייה לכלי הפסולת וחזרו על התהליך עבור העצם הפמורית השנייה.לאחר השלמת שלב זה, השתמש בפיפטה בעדינות כדי לפרק שאריות של מח עצם שלא נשברו במהלך תהליך השטיפה, במטרה ליצור תרחיף של תאים בודדים. פעולה זו תארך בין 5 ל-10 דקות של פיפטינג. העבר את תרחיף התאים הבודדים למבחנה קונית של 50 ml, ושטוף את הפלטה לפחות שלוש פעמים עם 10 ml של מדיום.בכל פעם, סבבו את התאים במערבל צנטריפוגי (spin down), הסירו את המדיום והחזירו את התאים לסוספנזיה על ידי שפשוף נחרץ ומהיר של האצבעות בתחתית המבחנה. כדי להסיר את תאי הדם האדומים (RBCs), נבצע ליזיס באמצעות מים. שיטה נוספת להסרת תאי דם אדומים היא ליזיס באמצעות אמון חלוריד.שתי השיטות תוארו במאמרי וידאו קודמים של JoVE. בידוד תאי T חיוביים ל-CD4 מקשרי לימפה של עכבר באמצעות ה-MACS purification (JoVE issue 9) והכנת גורם גדילה לתאי T מצ'יטות של חולדה (JoVE issue 10).לאחר הסרת תאי הדם האדומים (RBCs), אתם מוכנים כעת לתרבית. לכן, לפני שאני מדריך אתכם בתרבית תאי דנדריטיים, אני רוצה להכיר לכם את אתר ה-incucyte. אתר ה-incucyte יאפשר מעקב וניבוי של צמיחת תרביות תאים בתוך האינקובטור, כך שנוכל לצפות בתאים ולראות כיצד הם מתנהגים או אינם מתנהגים.לאחר הקמת התרבית, מקריבים אותה במגש בגודל המתאים ומגליסים לסגירה את אתר ה-incus. לאחר מכן, במחשב, מגדירים פשוט את מרווחי הזמן, בוחרים את הבארים שברצונכם לצלם ומשאירים את אתר ה-inky לאסוף עבורכם את הנתונים. הסרטונים בפרוטוקול זה ידגימו שינויים במורפולוגיה של תאי דנדריטיים in vitro.סרטונים אלו יוצאו ישירות מתוכנת אתר ה-Incus. ככל שתאי הדנדריטים מתפתחים מהיום הראשון עד היום ה-11, ניתן לראות שינוי מורפולוגי ממשי בעודם גדלים ומאמצים את הפנוטיפ של תאי דנדריטים. לאחר ליזיס והסרה של RBCs, התאים נשטפים במצע גידול לתאי דנדריטים ראשוניים ומונחים בצלחות בריכוז של 5 מיליון למיליליטר.יש לתרבת תאים אלו תחילה במצע תרבית לתאי דנדריטיים ראשוניים, ומאוחר יותר נתרבת אותם במצע DC משני, המועשר ב-40 ng/ml IL-4 וב-100 ng/mL TNF-α. ציטוקינים אלו יסייעו בפיתוח תאים דנדריטיים בשלים הדומים לתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים. כעת אראה לכם כיצד נראות התרביות במהלך התפתחותן וכיצד לתחזק אותן לאורך זמן.לאחר שזרעתם את התאים, ניתן לגדל את התאים הדנדריטיים למשך 72 שעות לפני החלפת המדיום הראשונה. כך תיראה תרבית טיפוסית מיד לאחר זריעת התאים ביום הראשון. וכאן ניתן לראות מבט מקרוב על התאים.ביום השלישי, ניתן לראות שהתאים החלו להיצמד לפיתח אך טרם אימצו את הפנוטיפ הקלאסי של תאי דנדריטיים. ביום הרביעי, יש להסיר את המצע ולהוסיף 10 mils של מצע טרי לתרבית תאי DC ראשוניים באמצעות שאיבה של המצע. ביום הרביעי, נסיר את הלימפוציטים וכל תא אחר שאינו נצמד.כעת ניתן להחזיר את התרביות לאינקובטור למשך שלושה ימים נוספים, שבעה ימים לאחר הזריעה הראשונית. כך תיראה תרבית טיפוסית. ניתן לזהות כי הגיע הזמן לפיצול התאים ולהעברתם לכלי חדש.ביום השביעי, מסירים את התאים הדנדריטיים מהפלטה על ידי שאיבת המצע, ולאחר מכן מוסיפים EDTA סטרילי בריכוז 300 millimolar ומדגירים למשך חמש דקות. לאחר מכן, שוטפים את הפלטה שוב ושוב תוך החזקתה בזווית של 45 מעלות והעברת תמיסת ה-EDTA באמצעות פיפט אל גב הפלטה. פעולה זו תבוצע במשך מספר דקות כדי להבטיח את הסרתם של כל התאים הדנדריטיים הדבקים.אוספים את התאים לשפופרת קונית של 50 ml ושוטפים אותם פעמיים עם מצע DC משני. לאחר מכן, התאים סספנדים מחדש ונזרעים בריכוז של 5 מיליון תאים לצלחת. תאי דנדריטיים מיום שבע שסורגבו מחדש שוקעים במהירות לתחתית הצלחת, נצמדים ומתחילים להיפרש.כפי שניתן לראות כאן בסרטון מאתר Zichy, סרטון זה צולם בתוך האינקובטור לאורך יומיים כדי להראות את התפתחות התאים הדנדריטיים, מהריplating הראשוני שבוצע ביום השביעי ועד תחילת היום התשעי. ניתן להפעיל תאים דנדריטיים מורפולוגיים באמצעות פולס של אנטיגן על ידי הוספת 2 µg/mL של LPS, יחד עם 100 µg של ova לשימוש עם T-cells שסוננו מעכברי OT-II, להם T-cells חיוביים ל-CD4 ספציפיים ל-ova. אם אתם משתמשים באנטיגן אחר, חשוב לוודא שאתם משתמשים בריכוז אופטימלי של אנטיגן עבור הפולס של התאים הדנדריטיים. כאן, ה-ova וה-LPS מתווספים למצע ראשוני כך שהריכוז הסופי של LPS יהיה 2 µg/mL ב-20 mL, וה-ova יהיה 100 µg/mL ב-20 mL.הנה תמונה של תרבית טיפוסית של תאים דנדריטיים ביום ה-10. ניתן לראות בתמונה זו כי המורפולוגיה אופיינית מאוד לתא מציג אנטיגן. תמיד יש לבדוק את אחוז התאים הדנדריטיים החיוביים ל-CD 11 C באמצעות fax.זאת כדי להבטיח שתהיה בידיכם תרבית טהורה יחסית של תאים דנדריטיים לשימוש בניסויים שלכם. כאן אנו משתמשים ב-IncuCyte של SEN instruments כדי לנטר את האקטיבציה של תאים דנדריטיים שטופלו ב-LPS וקיבלו פעימה של אנטיגן ביום ה-10. סרטון זה חולש על תקופה של 24 שעות מיד לאחר הוספת ה-LPS והפפטיד, ובמהלכו התאים הדנדריטיים הופכים לפעילים יותר וישנם שינויים מורפולוגיים ברורים.לאחר שהתאים הדנדריטיים הופעלו במהלך דחף האנטיגן, ניתן לאסוף אותם שוב על ידי דגירה עם 300 millimolar EDTA ושטיפת הפלטה. כעת, יש לסובב את התאים במ centriuge, לשטוף פעמיים עם 50 mils של מצע RPMI כדי להסיר אנטיגן עודף, ולסמן אותם בצבע cell tracker המתאים. בניסוי זה, אבצע הדמיה של התאים בקשריה הלימפטיקה המפשעת.יהיה עלינו להזריק בין שניים לחמישה מיליוני תאי דנדריטים תת-עורית לאזור השפשפת של העכבר המוצג כאן. לאחר מכן נמתין 24 שעות כדי לאפשר לתאי הדנדריטים להגיע לקשרי הלימפה המיועדים. בסרטון זה, תאי הדנדריטים מסומנים באמצעות CMF two hc, צבע מעקב תאי כחול.ניתן לראות תאים דנדריטיים המקיימים אינטראקציה עם תאי T מסומנים, הספציפיים לאנטיגן של volin. תאי T אלו מסומנים באמצעות ccf SE. ניתן להשתמש גם ב-C-M-T-M-R או בכל אחד מצבעי ה-cell tracker האחרים כגששים מולקולריים. זהו שלב ההפעלה המוקדם של תאי T המקיימים אינטראקציה עם תאים דנדריטיים.בשל העובדה שהם ספציפיים לאנטיגן, ניתן לראות שהתאי T נצמדים לזרועות של התאים הדנדריטיים המסומנים בכחול. בכך מסתיים הפרוטוקול שלנו המדגים את ההכנה והשימוש בתאים דנדריטיים ממחילת עצם של עכבר בניסוי דימוי בעל שני כפתורים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

generation-bone-marrow-derived-murine-dendritic-cells-for-use-2

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים צעד אחר צעד הוראות עבור הדור של מפלצות הילוד וכן לנתיחה והכנת התימוס עבור vivo לשעבר הדמיה על ידי מיקרוסקופית 2-פוטון.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

תאים דנדריטים ספיגת אנטיגנים ולנדוד אל האיברים החיסונית להציג אנטיגנים לתאי T מעובד. Qdot ננו תיוג מספק אות ניאון ארוכת טווח ויציבה. זה מאפשר מעקב של תאים דנדריטים לאיברים שונים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

סרטון זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאים דנדריטיים - תאים מציגי אנטיגן מרכזיים המפעילים תאי T - ממח העצם של עכבר בוגר.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

מעקב של תאים באמצעות MRI זכה לתשומת לב ראויה לציון בשנים האחרונות. פרוטוקול זה מתאר את התיוג של תאים דנדריטים עם פלואור...

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

במחקר זה אנו מציגים מערכת תרבית במבחנה שיכולה לייצר ביעילות pDCs על ידי תרבית משותפת של אבות לימפואידים נפוצים עם תאי הזנה AC-6 בנוכחות ליגנד Flt3.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

חקור את הכנת תאים דנדריטיים ממח עצם עכברים לצורך הדמיה בשני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות אנטיגן-תא T בבלוטות הלימפה החיות.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

גלה סרטונים נוספים