Name: מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: למדו כיצד לבצע מעבר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתנאי תרבית ללא תאי מאכלי, תוך שימוש במטריגל ודיספאז. השיטה מאפשרת שמירה על פלוריפוטנטיות ואימות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד&quot;ר Amander קלארק, ד&quot;ר ג&#39;רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.

פיצול hESCs מ Matrigel כדי Matrigel בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על Matrigel ניתן לפצל 1:03-01:05 עוד צלחת Matrigel, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CM וצלחות Matrigel מוכנים כמתואר לעיל לפני הפיצול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של פיצול, לשטוף היטב עבור כל פיצול עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של 1mg/ml Dispase (לדלל פתרון מניות 5mg/ml עם DMEM/F12 התקשורת) זה טוב, דגירה על 37 ° C במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של ES התקשורת ללא bFGF, השתמש מגרד תא לגרד את מושבות בתחתית הבאר, לאסוף את hESCs מושעה בצינור בז 50 מ&quot;ל, ו גלולה ידי צנטריפוגה 200 גרם ב 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי בצלחת מחדש hESCs על צלחות Matrigel, תחילה לשטוף את הצלחות Matrigel עם DMEM/F12 ולהוסיף 2.5ml של CM בתוספת 10ng/ml bFGF לכל טוב. Resuspend hESC גלולה בהיקף מתאים של CM בתוספת 10ng/ml bFGF, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה שלוש פעמים. (הערה: כאשר hESCs עבור פיצול באים צלחות Matrigel, גושים קל מאוד לשבור, ולכן שלושה סיבובים של pipetting מספיק ועוד pipetting עלול לשבש את יתר המושבות ולהפוך תאים בודדים). Aliquot 0.5 מ&quot;ל של השעיה hESC גושים לכל גם הצלחת Matrigel 6-היטב כדי להשיג 3ml לכל גם נפח סופי. מניחים את צלחת 37 ° C חממה. </li></ol> זיהוי סמנים pluripotency ידי מיקרוסקופית immunofluorescence מיקרוסקופיה immunofluorescence משמש כדי לבחון את הביטוי של סמנים hESC pluripotency אוקטובר-4-4 ו SSEA במהלך culturing. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מדיה מאחד לשטוף היטב עם 1 × PBS, pH 7.4. הוסף 2ml של פורמלדהיד 3.7% ל גם לתקן עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף מתנול 2ml אל הבאר מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, ולחסום עם 1ml של serume שור 0.2% אלבומין (BSA) עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של נוגדן אוקטובר-4 או anti-h/mSSEA-4 (1:200 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה. (הערה: עבור מכתים SSEA-4, לעבור ישירות לשלב 6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף FITC-מצומדות ארנב IgG (1:500 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, ולשים ירידה של פתרון הרכבה (יכול להכיל DAPI אם להדמיה גרעינית הרצוי) במרכז היטב. שים coverslip על גבי התאים, חותם עם לק, ולהעריך על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. </li></ol> אדם בתאי גזע עובריים קבלות ES התקשורת (תא גזע עובריים התקשורת): DMEM/F12 - 400ml נוק סרום תחליף - 100 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו - 5 מ&quot;ל 200mm GlutaMax / BME פתרון - 5 מ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין - 5 מ&quot;ל מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה hESC בבקבוקים 500ml ב 4 ° C. טוב לכל היותר שבועיים. MEF התרבות מדיה: DMEM - 1000ml FBS - 100 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו - 10 מ&quot;ל גלוטמין - 10 מ&quot;ל Penicllin / סטרפטומיצין - 10 מ&quot;ל מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה MEF ב 4 ° C. הפתרון 200mm Glutamax / BME: Glutamax - 100 מ&quot;ל β-mercaptoethanol (פתרון במלאי ב 14.3M) - 140 μ1 מערבבים היטב שני פתרונות ואז 10ml מנות aliquot. שמור aliquots ב -20 ° C. bFGF פתרון (הריכוז הסופי של המניה: 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל): bFGF (FGF2) - 50 מיקרוגרם 0.1% ב BSA 1xPBS, pH 7.4 - 5 מ&quot;ל ממיסים 50 מיקרוגרם bFGF ב BSA 0.1% 5 מ&quot;ל לעשות המניה 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. Aliquot לתוך μl 500 חלקים. חנות ב -80 ° C. Collagenase IV פתרון (1mg/ml): Collagenase IV - 50 מ&quot;ג DMEM/F12 מדיה - 50 מ&quot;ל מוסיפים את אבקת IV collagenase לצינור בז 50 מ&quot;ל. ב למכסה המנוע, לערבב 50 מ&quot;ל של DMEM/F12 התקשורת סטרילית. הפתרון וורטקס דקות 1 &lt;. כדי לוודא את אבקת מתמוסס. ב למכסה המנוע, לעבור 0.22 מיקרומטר לסנן לתוך צינור חדש סטרילי בז 50 מ&quot;ל. פתרון זה הוא טוב לכל היותר 2 שבועות מאוחסנים 4 ° C. Dispase פתרון (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 מדיה - 8ml Dispase מסחרי Aliquot 5mg/ml פתרון ולאחסן ב -20 ° C. מדולל dispase כדי 1mg/ml באמצעות DMEM/F12. פתרון זה יכולים להישמר במשך שבוע 1 ב 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

זו סדרה של 3 סרטונים מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין (וידאו 1), כיצד מעבר להם Matrigel תא ללא מזין צלחות (וידאו 2), וכיצד לשמור על hESCs ידי passaging במזין Matrigel תא ללא תנאים (וידאו 3). מחקרים קודמים הראו כי רבים ותחזוקה של, hESCs קיימא מובחן דורש על התרבות תאים מזין מומת MEF. עם זאת, ניסויים רבים, אוכלוסיה טהורה של hESCs ללא זיהום תא מזין נדרשת. כדי להשיג מטרה זו, אנו הדגימו כיצד hESCs קטע מתוך צלחות MEF מזין מזין את התאים ללא צלחות Ma...

<table><tbody><tr><td>תחליף סרום Knockout (KSR)</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> חומצות אמינו שאינן חיוניות</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, על ידי Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רבוי (FBS)</td><td>ריאגנט</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>הנדסת ביו-רפואית</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>ריאגנט</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>דיספז (Dispase)</td><td>ריאגנט</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>ריאגנט</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Oct-4</td><td>ריאגנט</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;Mouse IgG3 מצומד ל-rythrin</td><td>ריאגנט</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG מצומד ל-FITC</td><td>ריאגנט</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

מ mefs כדי matrigel 3: hescs passaging מ matrigel על matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם.

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

סרטון זה מדגים כיצד לשמר את צמיחתן של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתנאים ללא תאי מאכילה (feeder cell-free) וכיצ nào לבצע מעבר (passage) רציף...

כדי לפצל תאי גזע עובריים אנושיים שגודלו על Matrigel לשתי פלטות Matrigel. נתחיל עם פלטה של שישה בארות עם תאי גזע עובריים על Matrigel שהגיעו למצב של התלכדות (confluence), אותם ניתן לפצל ביחס של 1:3 או 1:5 לפלטת Matrigel אחרת. פעולה זו מאפשרת לבארות להגיע שוב למצב של התלכדות, ארבעה עד חמישה ימים לאחר הפיצול ביום שבו בוצע הפיצול.שטפו כל באער שעתיד להיות מופרד ב-XPBS pH 7.4. לאחר מכן, הוסיפו לכל באער מיליליטר אחד של פסטה בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, והדגירו ב-37 degrees Celsius למשך שלוש דקות. שטפו כל באער שלוש פעמים עם XPBS pH 7.4.לאחר מכן, הוסיפו 1 ml של מצע גידול לתאי גזע עובריים ללא BF GF והשתמשו בגורד תאים (cell scraper) כדי לגרד את המושבות מתחתית הבאר. אספו את תאי הגזע העובריים התלוים בתוך מבחנה מסוג Falcon בנפח 15 ml והשקיעו אותם באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי להשתיל מחדש את תאי הגזע העובריים האנושיים על פלטות matrigel, שטפו תחילה את פלטות ה-matrigel עם D-M-E-M-F 12 והוסיפו 2.5 ml של מצע meth condition המועשר ב-10 ng/ml.BFGF לכל באר לאחר שסבבו את התאים בצנטריפוגה, השעו את משקע תאי הגזע האווריקולריים האנושיים בנפח מתאים של מצע תרבית מותאם. מצע המועשר ב-10 nanograms per mil. BFGF; העבירו את תליית התאים במטפטף מעלה ומטה שלוש פעמים.יש לזכור שגושי תאי הגזע מה-matrigel מתפרקים בקלות. לכן, פיפטינג של שלוש פעמים אמור להספיק כדי לפרק את הגושים, אך מבלי להפוך את המושבות לקטנות מדי. לבסוף, העבירו מנות של 0.5 milliliters של תרחיף תאי גזע עובריים אנושיים לכל באר כדי להגיע לנפח של three mils לבאר.בנפח הסופי, ודא שצבירי התאים מפוזרים באופן שווה, ולאחר מכן הנח את הפיתח במדגרה בטמפרטורה של 37 °C. בהתאם לקו תאי הגזע ה-amry הספציפי, תאי גזע amry יהיו שוב קונפלואנטים (confluent) ארבעה עד חמישה ימים לאחר הפיצול. כאשר המושבות יתחילו לגעת זו בזו, חשוב לדעת האם תאי גזע amry האנושיים שלך שומרים על פלוריפוטנציות או על תכונות גזע (stemness) בתרבית.כדי לבדוק את הפלוריפוטנטיות של התאים במהלך תרביות של תאי גזע עובריים, אנו משתמשים במיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה כדי לבחון את הביטוי של סממני הפלוריפוטנטיות, OCT4 ו-SSEA4, באחת הבארות. פלטת שש הבארות שלנו מקובעת ונצבעת עבור OCT4 ו-SSEA4. אם אנו רואים שהתאים מסומנים פלורסצנטית עבור שני הסממנים הללו, הרי שאנו יודעים שתאי הגזע העובריים האנושיים שלנו שמרו על הפלוריפוטנטיות וניתן להשתמש בהם לניסויינו.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לגדל ולתחזק תאי גזע עובריים אנושיים פלוטנטים, הן על תאי מזינים של פיברובלסטים עובריים והן בתנאים ללא תאי מזינים על מצע מטריגל. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. חלק 1 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 2 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

בידול בימוי של hESCs לתוך תאים ספציפיים יצרה עניין רב ברפואה רגנרטיבית. אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול...

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

אנחנו, בהתבסס על ידע מביולוגיה התפתחותית ומחקר שפורסם, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוירונים דופמינרגיים A9 במוח התיכון הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, שיהיו שימושיים למידול מחלות וטיפול בהחלפת תאים למחלת פרקינסון.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

כדי להימנע מהמגבלות הקשורות למעבר אנזימטי או מכני של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בתרבית על תאי הזנה, ביססנו שיטה מהירה, יעילה, חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לקצירת מושבות hESC או hiPSC המתוחזקות על שכבת תאי הזנה של פיברובלסטים אנושיים של עורלה באמצעות דיס-הדבקה בתיווך EDTA.

העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

למדו כיצד לבצע מעבר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתנאי תרבית ללא תאי מאכלי, תוך שימוש במטריגל ודיספאז. השיטה מאפשרת שמירה על פלוריפוטנטיות ואימות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

גלה סרטונים נוספים