הדמיה מפעיל T זיכרון תאים באוזן לאחר אינדוקציה של DTH המאמצת
14 באוגוסט 2008
כאן אנו להדגים שיטה גרימת הקלטה ההתקדמות של הצתה מאוחרת (DTH) סוג רגישות יתר באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של התגובה מפעיל T / תא זיכרון.
שלום, אני מלאני מת'יו. אני סטודנטית לתואר מתקדם במעבדה של מייקה הולינס באוניברסיטת קליפורניה ארווין, במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה. והיום, יחד עם ד"ר כריסטין ביטון, נראה לכם כיצד אנו מדמיינים את אוכלוסיית תאי ה-T של הזיכרון או את האפקטורים המגיבים באוזנו של חולדה.
ד"ר כריסטין ביטון תגרום תחילה לרגישות יתר מאוחרת DTH באוזן של חולדה. לאחר מכן נעבור לדימוי in situ של אוזן החולדה באמצעות מיקרוסקופיה פוטונית דו-פוטונית. לפני יומיים הזרקתי תאי T ספציפיים לאלבומין המסומנים ב-GFP לחולדה מסוג Lewis.
והיום אני עומד לאתגר את אותה חולדה באוזן. לכן, לאוזן ימין אני מזריק albumin. ולאוזן שמאל אני מזריק פשוט מעט PBS.
מינון האלבומין שאני מזריקה הוא 20 micrograms ב-20 microliter. האלבומין שבו אני משתמשת הוא תערובת ביחס של אחד לאחד של אלבומין מסומן ב-Texas Red ואלבומין לא מסומן. זוהי הזבובית שעל גבה אראה לכם כיצד אני מזריקה.
השתמשתי ביד שמאל, שכן אני ימני. ביד שמאל הסרתי את הכפפה כדי שאוכל להניח אצבע אחת מתחת לאוזן ואת השנייה מעליה כדי למתוח את העור, כך שאוכל לראות בדיוק היכן אני נמצא עם המחט ולהיכנס בין שתי שכבות העור באזור האוזן, שהוא דק מאוד. לשם כך אני משתמש במחטים בכיול 27 gauge כדי להשתמש במשהו דק במיוחד עבור החדירה.
אם אהפוך את זה, ניתן לראות בבירור לאן הלך ה-Texas red ולאן הלך ה-PBS. אנו נמצאים כעת 42 שעות לאחר ההאתגר, ואשתמש במיקרומטר בעל קפיץ כדי למדוד את עובי האוזן. אני אמדוד את שתי האוזניים, האוזן הימנית שקיבלה את אתגר האלבומין והאוזן השמאלית שלא קיבלה את האתגר, וההבדל בעובי האוזן ייתן לנו מושג לגבי עוצמת הדלקת.
הו, 62 0 60 0 61, 0 60 או 58 או 57 או 57. והאוזן השנייה 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. היי. אז כריסטין ביטון בדיוק נתנה לנו את החולדה שהיא הוציאה לאחר מדידת תגובת DTH.
הובלנו אותם לכאן על קרח. זוהי האוזן השמאלית של החולדה. ואנחנו נמצאים כעת במעבדתו של Ian Parker לביצוע מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
כעת אכין את האוזניים לצילום דו-פוטוני in situ. אכין כאן אחת מאוזני החולדה בבסיס האוזן. הרקמה עבה הרבה יותר וישנן כמה שערות בולטות שיהפכו את התהליך למסורבל אם פשוט אתחיל לחתוך לתוכן.
ראשית, אני פשוט أغגרוז מעט מהשיער הזה. אני מחזיק את האוזן בעדינות. האצבע שלי הופכת את השליטה ברקמה להרבה יותר קלה כאשר מחזיקים אותה בין האגודל לאצבע המורה.
אני מעדיף זאת על פני שימוש בפינצטה, מכיוון שבאמצעות פינצטה אני פשוט לא יכול להרגיש בקלות מה קורה לרקמה, ואנחנו תמיד חוששים לגרום נזק לרקמה. לכן, אנחנו רוצים להיות מסוגלים להרגיש את הפעולות שאנו מבצעים בה. לכן אני פשוט מעדיף להשתמש באצבעות שלי.
זוהי שכבת העור (dermis) המתקלפת מכאן באוזן של החולדה. בזמן שגזמתי חלק מהפרווה, יכולתי לגזוז בעדינות חלק מהדרמיס שפשוט מתקלף. ישנם מספרי דיסקציה קטנים מאוד לצורך כך, פשוט מספריים מעוקלים ונוחים.
אין לדקור את הרקמה, וניתן להתקדם מבסיס האוזן כלפי מעלה, תוך חיתוך עדין של חלק משכבת העור. איננו זקוקים לחלון גדול מאוד לצורך הדמיя. אזור זה, ממש כאן, יספיק כדי לקבל תמונות טובות של התאים החודרים לרקמה.
כפי שניתן לראות, ישנם עדיין כמה כלי דם שלמים כאן בבסיס האוזן ובמעלה כמעט עד לקצה האוזן. כל האזור הזה יהיה מתאים מאוד לדימות של DTH. לכן, אני אגזור את פיסת הרקמה שחשפתי כדי ליצור פיסת רקמה קטנה שנוכל להדביק לבמה של מכשיר הדימות.
אם כך, פשוט בצעו חיתוך כאן, סובבו אותו. אני יכול לחתוך כאן. יש לנו פיסת רקמה קטנה ויפה שנוכל להכין עבור הדמיה במיקרוסקופ הדו-פוטוני שלנו.
אלו הן לבישות כיסוי מפלסטיק שאינן נשברות, אותן חתכנו לגודל הרקמה שלנו. לאחר מכן, קיבענו את הרקמה עליהן באמצעות bet bond. לבסוף, הצמדנו את לבישות הכיסוי מפלסטיק שאינן נשברות לבמה של הדימות ה-insitu באמצעות גריז סיליקון.
אני אקח את פיסת רקמת האוזן הקטנה הזו; יש לה קימור קל, לכן אצטרך להחליק אותה בעוד אני מדביקה אותה. זה לא אידיאלי, אך זה יעבוד. אתם פשוט לוקחים אחת מזכוכיות המכסה הללו וגוזרים אותה, מעריכים בערך את גודל האוזן שלכם וגוזרים חלק שיהיה מעט גדול יותר ממה שאתם חושבים שיידרש.
כדי להצמיד את הרקמה לזכוכית המכסה, אנו משתמשים בדבק מהיר בטוח לרקמות הנקרא bet long. אנו רוכשים אותו מחברת 3M ומניחים מספר טיפות ממנו על זכוכית המכסה.
אני לא רוצה להשתמש בכמות גדולה מדי. כמו כן, יש לוודא שהדבק מפוזר באופן שווה. לכן, אקח פיסה קטנה של נייר לעדשות ואשתמש בפינה שלו כדי למרוח את הדבק על פני הזכוכית של כיסוי הדגימה כאן.
אני אוסיף מעט דבק נוסף, וברגע שהדבק הזה יבוא במגע עם מים, הוא יתקשה. לכן, עליכם להיות זהירים מאוד עם דגימת הרקמה שלכם. אני אתפוס כאן את פינת הרקמה שסביר להניח שלא נדמיין, מכיוון שהיא נמצאת בחלק המעוקל.
אני אייבש את זה מעט. את החלק התחתון, פשוט על נייר העדשות כדי שיהיה יבש לגמרי. ואז אני אגע עם הפינה של רקמת אוזן החולדה הזו בזכוכית המכסה.
וזה אמור להתקשות מיד במקום שבו נגעתי. את השאר אני פשוט אשטיח מעט על ידי לחיצה עדינה על הקצוות שלו. כך שבתקווה נקבל מסגרת דימוי טובה.
כעת אני עומד להקשות את הדבק על ידי טבילה במצע. כדי למנוע מהדבק להגיע לחלק העליון של הרקמה, נהפוך אותה ונטבול אותה לאט, פינה אחת תחילה, במאגר המצע שלנו; היא אמורה להיצמד היטב, ואז נוכל לדגמה בתא הדמיון של הרקמה. כעת נמקם על הבמה את פיסת הרקמה שהכנו לדמיון in situ, פיסת רקמת הבירה.
כאן נמצאת פיסת הרקמה שלנו עם גריז סיליקון בחלקה התחתון, ואנו פשוט מניחים אותה בעדינות בזרם המדיום. כעת היא נצמדת לתחתית הבמה באמצעות גריז הסיליקון. נפעיל את זרימת המדיום כאשר גשש הטמפרטורה שלנו נמצא ממש לצידה.
ועכשיו נתמקד. לכן אני מדליקה את תאורת המיקוד שלנו, האור הבהיר. אני אקח את העדשה בעלת ההגדלה 20x ואוריד אותה אל תוך התא.
וודאו שזה אינו נוגע ברקמה. הביטו דרך העינית ומקדו את המבט על רקמת האוזן שלנו. והנה זה.
כאן ניתן לראות זקיקי שיער ירוקים בעלי פלואורסצנציה עצמית בשכבת העור של אוזן החולדה. מסביב לזקיקי שיער אלו נמצאת שכבה צפופה של קולגן. זוהי השכבה שאותה אנו מסירים לצורך דימות T photon של תאי T fector memory.
זקיקי השיער בעלי הפלואורסצנציה העצמית יסתירו את התמונה, כמו גם הקולגן הבהיר של השכבה העורית העליונה. אוקיי, כאן ניתן לראות שיש לנו APCs שספחו volin המשולב עם Texas red, והם שוכנים לאורך סיבי קולגן כחולים אלו. סיבי הקולגן הם כחולים בשל יצירת הרמוניה שנייה (second harmonic generation) שאנו מקבלים בדימוי פוטונים לאורך סיבי הקולגן.
יש לנו תאי T בעלי ניידות גבוהה. הם זוחלים מעלה ומטה לאורך סיבי הקולגן ומקיימים אינטראקציה עם ה-APCs. לכן, בסרטון זה ראיתם את ד"ר כריסטין ביטון מעוררת DTH אדופטיבי בחולדת לואיס.
כעת הצגנו בפניכם את הכנת האוזן לצילום, את תאי הזיכרון האפקטורים מסוג T המגיבים, את אוזן החולדה ואת טכניקות שני הפוטונים ששימשו לכך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטה להשראה והקלטה של תגובות רגישות מאוחרת (DTH) באוזן של חולדה, ולאחריה הכנה של רקמת אוזן של חולדה לצורך הדמיית דו-פוטון של תגובות תאי T.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
רקע
- רגישות מאחרית (DTH) היא תגובה חיסונית מרכזית.
- הבנת הדינמיקה של תאי T היא קריטית למחקר אימונולוגי.
- מיקרוסקופיית שני פוטונים מאפשרת דימוי in situ של תגובות תאיות.
- מודלים של חולדות משמשים נפוצות לחקר תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- להשראות ולהקלטת תגובות DTH באוזני חולדה.
- להדמיה של אוכלוסיות תאי T אפקטורים ותאי T זיכרון.
- לשיפור ההבנה של התנהגות תאי T in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של DTH ברקמת אוזן של חולדה.
- הזרקה של תאי T המסומנים ב-GFP.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית לצורך דימות.
- ניתוח in situ של תגובות תאי T.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של DTH במודל של אוזן חולדה.
- הדמיה של אוכלוסיות תאי T באמצעות מיקרוסקופיית דו-פוטון.
- תובנות לגבי הדינמיקה של תגובות חיסוניות in vivo.
- ניתן ליישם את השיטה שהודגמה במחקרים אימונולוגיים נוספים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לחקר תגובות DTH.
- דימוי דו-פוטוני יעיל לצפייה בהתנהגות של תאי T.
- מחקר זה תורם להבנת תגובות חיסוניות.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של דינמיקה של תאי T מסוג effector memory בתגובה חיסונית ספציפית לרקמה, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף של מטרות אימונולוגיות. על ידי שילוב של השראת DTH אדופטיבית עם דימוי דו-פוטוני, היא מספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית על ניידות תאי T ועל אינטראקציות עם תאים מציגי אנטיגן. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור התנהגות תאית לתוצאות חיסוניות תפקודיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של גיוס והפעלה של תאי T זיכרון/אפקטור מסוג CCR7- in vivo.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות אימונומודולטוריות באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות בין תאי T ל-APC.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח (triage) על ידי מתאם בין דפוסי ניידות של תאי T לבין עוצמת הדלקת במערכת הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת נתחי רקמה סטנדרטיים לצורך דימות עקבי וניתן לשחזור של דינמיקת תאי חיסון.
- ערך תפעולי: ביסוס פלטפורמה למדדים כמותיים כגון מעקב אחר תאים, תדירות אינטראקציות ועומק חדירה.
- יכולת הרחבה: שימוש ברקמת אוזן שעברה עיבוד מינימלי, התואמת לתהליכי עבודה של דימות ברזולוציה גבוהה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות אימונולוגית באמצעות שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ואינטראקציות בין תאים במהלך הדמיה.
- ערך תפעולי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למעקב אורכי של תגובות חיסוניות באותו מודל.
- צמצום סיכונים: מפחית עמימות מנגנונית בזיהוי מועמדים מובילים על ידי אספקת ראיות ישירות למעורבות המטרה ברקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת שכלול איטרטיבי של מועמדים לאימונו-מודולציה על בסיס התנהגות תאי חיסון בזמן אמת.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות ויזואליזציה של תגובות תאי T לגירוי אנטיגני במודל DTH מבוקר.
- סריקה: מספק דגימות רקמה מוכנות לבדיקה עם עובי וקיבוע סטנדרטיים לצורך דימות דו-פוטוני הניתן לשחזור.
- אנליטיקה: מייצר פלטי קוונטיביים הכוללים מהירות תאים, אורך מסלול והתפלגות מרחבית ביחס לקולגן ו-APCs.
- מחקר טרנסלציונלי: מבטיח רציפות משלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי שימוש באותו מודל חולדה הן לצורך ההשראה והן לצורך הדימות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות ניתנת לשימוש חוזר, שניתן להחילה על מטרות אימונולוגיות מרובות ועל שורות תאי T ספציפיות לאנטיגן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של תפקוד תאי T זיכרון אפקטורים ברקמה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הרקמה ותנאי הדימות כדי לשפר את השחזוריות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות המשך (go/no-go) על ידי קישור דינמיקת תאי T לתוצאות דלקתיות במודל חיזוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי תיקוף השפעות המטרה על התנהגות תאי מערכת החיסון לפני ביצוע מחקרי in vivo יקרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהעברה מאומצת של תאי T, השראת DTH ומיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים דו-פוטוניים בעלי יכולת יצירת הרמוניה שנייה (SHG) להדמיית קולגן.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול ברקמות כדי להבטיח קיבוע עקבי וחיוניות במהלך ההדמיה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום שיטת הכנת האוזן לסוגי רקמות אחרים או למודלים של מחלות.
- מוגבל בשל הצורך בקווי תאי T ספציפיים לאנטיגן ובביקורות מתאימות להבחנה בין דלקת ספציפית לדלקת לא ספציפית.
