הדמיה מפעיל T זיכרון תאים באוזן לאחר אינדוקציה של DTH המאמצת
August 14th, 2008
כאן אנו להדגים שיטה גרימת הקלטה ההתקדמות של הצתה מאוחרת (DTH) סוג רגישות יתר באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של התגובה מפעיל T / תא זיכרון.
היי, אני מלאני מת'יו. אני סטודנט לתואר שני במעבדה של מיכה הולינס באוניברסיטת קליפורניה אירווין במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה. והיום, יחד עם ד"ר כריסטין ביטון, אנו הולכים להראות לכם כיצד אנו מדמיינים את אפקט התגובה או את אוכלוסיית תאי הזיכרון של תאי T באוזן של חולדה.
ד"ר כריסטין ביטון תגרום תחילה לרגישות יתר מסוג מושהה DTH באוזן העכברוש. ואז נעבור להדמיה באתרה של אוזן החולדה על ידי שתי מיקרוסקופיות צילום. לפני יומיים הזרקתי GFP עם תווית של תאי T ספציפיים של אלבומין בהיפר ללואיס.
והיום אני הולך לאתגר את אותה חולדה באוזן. אז באוזן ימין אני הולך להזריק אלבומין. ובאוזן שמאל אני פשוט הולך להזריק קצת PBS.
מינון האלבומין שאני מזריק הוא 20 מיקרוגרם ב-20 מיקרוליטר. והאלבומין שאני משתמש בו הוא תערובת אחת לאחת של טקסס רד עם תווית של אלבומין וללא תווית של אלבומין. אז זה החלק הימני שבו אני הולך להראות לכם איך אני הולך להזריק.
אז יש לי יד שמאל, אני ימנית. אז הורדתי את הכפפה ביד שמאל כדי שאוכל לשים אצבע אחת מתחת לאוזן ואת השנייה מעל כדי למתוח את העור כך שאוכל לראות בדיוק איפה אני נמצא עם המחט ולהיכנס בין שתי שכבות העור באוויר, שהוא דק מאוד. אז בשביל זה אני משתמש במחטים של 27 מד כדי שיהיה משהו דק במיוחד להיכנס לשם.
אז אם אני מסובב את זה, אתה בהחלט רואה לאן נעלם האדום של טקסס ולאן נעלם ה-PBS. אז אנחנו עכשיו 42 שעות אחרי האתגר כאן ואני הולך להשתמש במיקרומטר קפיץ כדי למדוד את עובי האוזן. אז אני הולך למדוד את שתי האוזניים, האוזן הימנית שאותגרה עם האלבומין והאוזן השמאלית שלא אותגרה וההבדל בעובי שלך ייתן לנו מושג על עוצמת הדלקת.
אה, 62 0 60 0 61, 0 60 או 58 או 57 או 57. והאוזן השנייה 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hi.So כריסטין ביטון נתנה לנו זה עתה את החולדה שהיא הסירה לאחר שמדדה את תגובת ה-DTH.
העברנו אותם לכאן על קרח. זוהי האוזן השמאלית של החולדה. ואנחנו כאן עכשיו במעבדה של איאן פרקר ועושים שני מיקרוסקופ פוטונים.
אז אני הולך להכין את האוזניים האלה להדמיית שני פוטונים באתר. אז אני הולך להכין את אחת מאוזני העכברוש כאן בבסיס האוזן. הרקמה הרבה יותר עבה ויש לנו קצת שיער בולט שהולך להיות קצת מבולגן אם רק אתחיל לחתוך לתוכו.
אז הדבר הראשון שאני הולך לעשות זה פשוט לגזור קצת מהשיער הזה. אני רק מחזיקה בעדינות את האוזן. האצבע שלי מקלה מאוד על השליטה ברקמה כשאתה מחזיק אותה בין האגודל לאצבע המורה.
אני מעדיף את זה על פני שימוש במלקחיים כי מלקחיים, אני פשוט לא יכול להרגיש מה הרקמה עושה באותה קלות ואנחנו תמיד מודאגים מפגיעה ברקמה. אז אנחנו רוצים להיות מסוגלים להרגיש מה אנחנו עושים עם זה. אז אני פשוט אוהב להשתמש באצבעות שלי.
זוהי שכבת העור המתקלפת מכאן באוזן העכברוש. אז בזמן שגזזתי חלק מהשיער, הצלחתי לקצץ בעדינות חלק מהדרמיס הזה רק סוג של קילוף. יש כמה מספריים מנתחים קטנים מאוד כדי לעשות זאת, רק כמה מספריים מעוקלים נחמדים.
אתה לא רוצה לדקור את הרקמה ואתה יכול להתקדם מבסיס האוזן למעלה, פשוט לחתוך בעדינות שכבה עורית כלשהי. אז אנחנו לא צריכים חלון גדול מאוד להדמיה. האזור הזה ממש כאן יספיק כדי לקבל כמה תמונות נחמדות של התאים החודרים לרקמה.
אז אתם יכולים לראות שיש לנו כמה כלי דם שלמים עדיין כאן בבסיס האוזן ופחות או יותר עד קצה האוזן. כל האזור הזה יהיה ממש טוב להדמיית DTH. אז אני הולך לחתוך את פיסת הרקמה שחשפתי כדי ליצור פיסת רקמה קטנה שנוכל להדביק לשלב ההדמיה שלנו.
אז פשוט תעשו כאן חתך, תהפכו את זה. אני יכול לחתוך כאן. יש לנו פיסת רקמה קטנה ונחמדה שאנו יכולים להכין על שני הפוטונים שלנו להדמיה.
אלה פתקי כיסוי פלסטיק בלתי שבירים שאנו חותכים לגודל הרקמה שלנו. ואז אנחנו מרכיבים את הרקמה על אלה באמצעות אגרת ההימור. ואז אנו מאבטחים את החלקות כיסוי הפלסטיק הבלתי שבירות הללו באמצעות שומן סיליקון לשלב ההדמיה הבסיסית שלנו.
אני הולך לקחת את החתיכה הקטנה הזו של רקמת אוויר, יש לה קצת עקמומיות, אז אני אצטרך לשטח אותה כשאני מדביק אותה. לא אידיאלי, אבל זה יעבוד. אז אתה פשוט לוקח אחד מפתקי הכיסוי האלה ואתה חותך אותו, סוג של הערכת גודל האוזן שלך ופשוט חותך קצת יותר גדול ממה שאתה חושב שזה הולך להיות.
כדי להרכיב את הרקמה שלנו על החלקת הכיסוי. אנו משתמשים בדבק סופר בטוח לרקמות הנקרא הימור ארוך. אנחנו מקבלים את זה מ-3M ופשוט שמים כמה טיפות מזה על פתק הכיסוי שלנו.
אני לא רוצה שיהיה לי יותר מדי. ואתה גם רוצה לוודא שהוא מפוזר באופן שווה. אז אני פשוט אקח פיסת נייר עדשה קטנה ואשתמש בפינה שלה כדי לנדף את הדבק על פני החלקה של הכיסוי כאן.
הולך כל כך למעלה קצת בדבק הנוסף וברגע שהדבק הזה נוגע במים, הוא ירפא. אז אתה רוצה להיות זהיר מאוד עם דגימת הרקמה שלך. אז אני הולך לתפוס את פינת הרקמה שלו כאן שכנראה לא נצלם כי הוא נמצא בחלק המעוקל.
אני הולך לייבש אותו קצת. החלק התחתון שלו, רק על נייר העדשה כך שהכל יבש. ואני הולך לגעת בפינה שלו, ברקמת אוזן העכברוש הזו להחלקת הכיסוי.
וזה אמור לרפא מיד את המקום שבו נגעתי בו. את השאר, אני פשוט הולך לשטח קצת על ידי לחיצה עדינה עליו, על הקצוות שלו. אז אני מקווה שתהיה לנו מסגרת הדמיה יפה.
אז עכשיו מה שאני הולך לעשות זה לרפא את הדבק על ידי טבילתו במדיה. אז כדי למנוע מהדבק לעלות על גבי הרקמה, אנו הופכים אותו ולאט לאט טובלים אותו בפינה אחת תחילה במאגר המדיה שלנו ויש להדביק אותו יפה ונוכל לצלם אותו בתא הדמיית הרקמות שלנו. אז עכשיו אנחנו הולכים להרכיב את פיסת הרקמה שהכנו להדמיה באתרה, פיסת רקמת הבירה על הבמה.
אז הנה פיסת הרקמה שלנו עם שומן הסיליקון בתחתיתה, ואנחנו פשוט מניחים אותה בעדינות בזרימת המדיה. עכשיו הוא דבוק לתחתית הבמה הוא שומן הסיליקון. הבהר את זרימת המדיה עם בדיקת הטמפרטורה שלנו ממש לידו.
ועכשיו אנחנו הולכים להתמקד. אז אני הולך להדליק את המיקוד שלנו, את האור החדש, את הקליפה הבהירה שלנו. אז אני הולך לקחת את יעד ה-20x שלנו ולהוריד אותו למטה לתוך החדר.
ודא שהוא לא נוגע ברקמה. הסתכלו דרך העינית והתמקדו ברקמת האוזן שלנו. והנה זה.
כאן אתה רואה זקיקי שיער ירוקים אוטופלואורסצנטיים בשכבת העור של אוזן החולדה. סביב זקיקי השיער הללו שכבה צפופה של קולגן. זוהי שכבה שאנו מסירים עבור הדמיית פוטון T של תאי הזיכרון של פקטור T.
זקיקי השיער האוטו-פלואורסצנטיים יטשטשו את התמונה כמו הקולגן הבהיר של שכבת העור העליונה. אוקיי, אז הנה אתם יכולים לראות שיש לנו נגמ"שים שקלטו וולין מצומד אדום טקסס, והם שוכנים לאורך סיבי הקולגן הכחולים האלה. סיבי הקולגן כחולים עקב הדור ההרמוני השני שאנו נכנסים להדמיית פוטונים לאורך סיבי הקולגן.
יש לנו tcell תנועתי מאוד. הם זוחלים למעלה ולמטה בסיבי הקולגן ומקיימים אינטראקציה עם הנגמ"שים. אז בסרטון הזה ראיתם את ד"ר כריסטין ביטון, גורמת ל-DTH מאמץ בחולדת לואיס.
ואז הראינו לכם את הכנת האוזן שלנו להדמיה, את תאי הזיכרון של אפקטור ה-T המגיבים, ואת אוזן החולדה ואת שתי טכניקות הפוטונים שלנו כדי לעשות זאת.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטה להשראת והקלטת תגובות רגישות מעוכבת מסוג מאוחר (DTH) באוזן של חולדה, ואחריה הכנה של רקמת אוזן חולדה להדמיה דו-פוטונית של תגובות תאי T.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- נוירולוגיה
- ביופיזיקה
רקע
- רגישות מעוכבת מסוג מאוחר (DTH) היא תגובה חיסונית מרכזית.
- הבנת דינמיקה של תאי T חיונית למחקר אימונולוגי.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מאפשרת הדמיה של תגובות תאיות במקום.
- מודלי חולדה נפוצים לחקר תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- להשרת ולהקליט תגובות DTH באוזני חולדה.
- להדגים אוכלוסיות של תאי T מבצעים וזכרון.
- לשפר את ההבנה של התנהגות תאי T בחיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראת DTH ברקמת אוזן חולדה.
- הזרקת תאי T מסומנים ב-GFP.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה.
- ניתוח של תגובות תאי T במקום.
תוצאות עיקריות
- השראת DTH מוצלחת במודל אוזן החולדה.
- הדגמה של אוכלוסיות תאי T באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- תובנות לגבי הדינמיקה של תגובות חיסוניות בחיים.
- שיטה שהוכחה שניתן ליישמה למחקרים אימונולוגיים נוספים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה אמינה לחקר תגובות DTH.
- הדמיה דו-פוטונית יעילה להתבוננות בהתנהגות תאי T.
- מחקר זה תורם להבנת התגובות החיסוניות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
