גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

על מנת לחקור את אינטראקציות ה-DNA של הכרומטין השולטות בביטוי גנים ספציפיים של עצבים במוח האנושי, תחילה יש להשיג אוכלוסייה טהורה של גרעיני עצב כדי לעשות זאת. רקמת המוח האנושית לאחר המוות הומוגנית והגרעינים הכוללים מבודדים באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. לאחר מכן הגרעינים מסומנים בנוגדנים ספציפיים לנוירונים המבודדים באמצעות מיון מטרי זרימה, ולבסוף מרוכזים באולטרה-צנטריפוגה.

היי, אני אניש מתן מהמעבדה של ד"ר שרון מק בריאן כאן במחלקה לפסיכיאטריה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס. היום אראה לכם נוהל לבידוד גרעיני עצב מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. אז בואו נתחיל.

עבור כל דגימת גרעינים שיש למיין, התחל עם אלף מיליגרם של רקמת מוח קפואה לאחר המוות. עם כמות זו, אתה יכול להשיג כ -5 מיליון גרעינים עצביים לאחר מיון מופעל פלואורסצנטי. כדי להתחיל במיצוי הגרעינים, הניחו 250 מיליגרם של רקמת מוח לתוך למטה המכיל חמישה מיל של מאגר ליזה, והניחו אותו על קרח.

ברגע שהרקמה מפשירה אותה למשך דקה אחת בזמן שהיא על הקרח. לאחר הפלה, העבירו את הרקמה ההומוגנית לצינור אולטרה-צנטריפוגה שקוף של 15 מיל ולאחר מכן הניחו את הצינור על קרח. חזור על הומוגניזציה זו עבור הרקמה הנותרת.

לאחר מכן, פיפטה בזהירות תשעה מילים של תמיסת סוכרוז לתחתית צינורות האולטרה-צנטריפוגה כדי להגדיר שיפוע ריכוז כך שתמיסת הרקמה ההומוגנית תהיה על גבי תמיסת הסוכרוז. כעת שקלו את צינורות האולטרה-צנטריפוגה כדי להבטיח שהם מאוזנים במהלך האולטרה-צנטריפוגה. בצע התאמות למשקל על ידי הוספת מאגר ליזה לשכבה העליונה לאחר שקילת הצינורות, הנח אותם באולטרה-צנטריפוגה באמצעות דגימות האולטרה-צנטריפוגה של רוטור SW 28 ב-107163.6 RCF למשך 2.5 שעות בארבע מעלות.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, שאפו מהסנאט כמו גם את שכבת הפסולת שנמצאת בשיפוע הריכוז. היזהר לא להפריע לכדור בתחתית הצינור, המכיל את הגרעינים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של XPBS אחד לכל כדור ותן לו לשבת על קרח במשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, החייאה השעתה את הכדורים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הדגירה על הקרח מאפשרת לכדוריות להתמוסס מעט מעצמן, מה שמקל על השעיית הגרעינים מחדש, ובכך מפחית את כמות הלחץ שהגרעינים חווים. לאחר מכן העבירו את תליית ה-resus והגרעינים לשני צינורות צנטריפוגה מיל.

שלב את תמיסת הגרעין משניים מצינורות האולטרה-סנטאג' לכל צינור מיקרו צנטריפי ושוב, הניח את הדגימות על קרח. כעת, לאחר שמיצוי הגרעין הושלם, אני הולך לעבור לשלב הצביעה החיסונית על מנת לבודד גרעיני עצב לפי עובדות, מיון הדגימה המכילה גרעינים יודגר בתערובת צביעה חיסונית המורכבת מנוגדנים ראשוניים ומשניים, כמו גם חסימת קישורים ליצירת תערובת הצביעה החיסונית ב-1.2 מיקרוליטר של נוגדן ספציפי עצבי חדש ל-300 מיקרוליטר של XPBS אחד. לאחר מכן הוסף מאה מיקרוליטר של תערובת חוסמת, המכילה 0.5% BS, A ו-10% סרום קוד רגיל ב-XPBS אחד.

לבסוף, הוסף מיקרוליטר אחד של הנוגדן המשני הנקרא LOR 4 88. הכן גם כתם חיסוני לדגימת בקרה שלילית לתערובת כתם חיסוני זו. אל תכלול את הקצה החדש של הנוגדן העיקרי והחלף אותו ב-1.2 מיקרוליטר של XPBS אחד.

כעת מערבולת תערובות צביעה חיסונית ודגירה עליהן במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך בזמן שתערובות הצביעה דוגרות. הכן את דגימות גרעיני הבקרה עבור דגימת הבקרה השלילית Eloqua 20 מיקרוליטר של גרעיני טווח ה-resus לתוך צינור של שני מיל המכיל 980 מיקרוליטר של XPBS אחד. הכינו גם בקרה לא מוכתמת, המכילה את תמיסת הגרעינים ו-PBS בלבד.

כעת Eloqua 20 מיקרוליטר מהגרעינים לתוך צינור אחר והגבירו את הנפח בחזרה למיל אחד עם XPBS אחד. לאחר מכן הניחו את כל הדגימות בחזרה על הקרח. בשלב זה תערובות הצביעה החיסונית הסתיימו.

דגירה מוסיפים 401 מיקרוליטר מהתערובת לדגימה המתאימה. דגימת הגרעינים קיבלה את התערובת המכילה גם חדש וגם LOR 4 88. דגימת הבקרה השלילית קיבלה תערובת המכילה רק את הנוגדן המשני LOR 4 88 בעוד שלא נוסף כתם חיסוני לדגימת הביקורת הלא מוכתמת.

לאחר מכן, העבירו את הדגימות לקולדרון וסובבו אותן בחושך למשך 45 דקות. כעת, לאחר השלמת הדגירה של 45 דקות, אני אעביר את הדגימות למתקן הליבה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס כדי לבצע מיון מופעל פלואורסצנטי במהלך ההובלה למתקן הליבה, הדגימות צריכות להישמר על קרח ובחושך. במתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה, הדגימות מסוננות תחילה דרך מסנן של 40 מיקרון ולאחר מכן הן עוברות דרך המכשיר למשך מספר דקות תוך שמירה על קור.

זה נעשה על מנת לקבל כמה נתונים ראשוניים לפני המיון. הבקרה הלא מוכתמת קובעת את מידת הקרינה השלילית. בהתבסס על מידע זה, התאם את רגישות המכונה לפלואורסצנטיות.

ההדברה המוכתמת משמשת לשליטה בשפעת. כל רעש רקע הנובע מחוסר הקרינה בשלב זה הגדר את השערים המתאימים הנדרשים למיון. מספר שערים שונים משמשים למיון דגימות.

הנה כמה נתונים אופייניים לשער הראשון. תרשים ניתוח פקס זה מציג מדגם מייצג לאחר כוונון השער. השער הראשון מזהה דפוסים של פסולת וגרעינים ברי קיימא על סמך שילוב של הגדרות כמו פלואורסצנטיות וחוויה חזותית כללית.

ציר ה-x מייצג פיזור קדימה, המתאים לגודל היחסי בעוד שציר ה-Y מייצג פיזור אתרים, המסביר מורכבות פנימית כגון גרעיניות. השער הראשון יכול גם לתת מושג על גודל הגרעינים השונים שנמצאים בדגימה שלנו. זה מאפשר להפריד את הפסולת מהגרעינים האמיתיים, והנה כמה נתונים אופייניים מהשער השני.

תרשים פקס זה מציג דוגמה לשער שני, המאפשר למיין גרעינים בנפרד תוך השלכת אגרגטים. שער זה בוחן את ההבדלים באורך הזמן שלוקח לגרעינים לעבור דרך הלייזר. אלה שהם אגרגטים בדרך כלל לוקח יותר זמן לעבור דרכם.

פרמטר מסוים זה חשוב מאוד מכיוון שהכללת אגרגטים עלולה להפריע לטוהר מכיוון שגרעין פלואורסצנטי כלשהו עשוי להיות קשור לגרעין שאינו פלואורסצנטי. לבסוף, הנה נתונים טיפוסיים מהשער השלישי. שער זה מוגדר לאורך גל פלואורסצנטי ספציפי התואם לזה של הפלואורון שנמצא בנוגדנים המשניים שלנו.

בתרשים פקס זה, אתם רואים את רמת הקרינה לאורך ציר ה-x וגלאי תעלות אדומות עמוקות, PECY 7 לאורך ציר ה-Y. כתמי נקודות אלה נותנים חזות טובה יותר בהשוואה פשוטה להיסטוגרמה של צבע יחיד. הצבת SCADA מאפשרת למיין ולהפריד גרעינים עצביים חדשים וחיוביים מגרעינים לא עצביים חדשים ושליליים.

לאחר בחירת כל השערים, הגרעינים ממוינים ל-XPBS אחד. לאחר שכל הדגימה עברה את מיון העובדות, בדוק את טוהר הסוג על ידי הפעלת Eloqua של הדגימה הממוינה דרך הכלי. הנה דוגמה לתוצאה אופטימלית.

כאן השווה את דגימת הנופש, המכילה אוכלוסייה מעורבת של הגרעינים ל-Eloqua הממוין שחיסל את רוב הגרעינים השליליים. שימו לב שאחוזי הטוהר מבוססים על מספר האירועים המזהמים את המדגם על סמך השערים שנקבעו. זכור כי בפעם הראשונה שהדגימה עוברת דרך המכונה, עלולה להתרחש הלבנה מסוימת, ובכך לגרום לעמעום מסוים כדי להסביר זאת, ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות מסוימות.

לאחר מיון הדגימה, התחל לעבד את הגרעינים. לשם כך, קח 10 מיל מהדגימה הממוינה והוסף שני מיל תמיסת סוכרוז, 50 מיקרוליטר של סידן כלורי מולארי אחד ו -30 מיקרוליטר של אצטט מגנזיום טוחנת אחת. אם יש פחות מ-10 מיל של דגימה ממוינת, הגדל את עוצמת הקול עד 10 מיל על-ידי הוספת XPBS אחד או כוונן את החומרים הנוספים בהתאם.

לאחר מכן, הפוך את הדגימה מספר פעמים והניח אותה על קרח למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, דגימת תכונת צנטריף ברוטור דלי נדנדה 1, 786 RCF למשך 15 דקות בארבע מעלות. לאחר הצנטריפוגה שאפו בזהירות מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור הלבן שנמצא בתחתית הצינור.

לאחר מכן ממיסים את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של התמיסה המתאימה הדרושה לניסויים הקודמים. במקרה זה, אנו ממיסים את הגלולה ואת מאגר ההורדה לניסוי השבב הבא. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה על ידי צינור למעלה ולמטה.

בשלב זה, אתה יכול להעביר את הגרעינים לצינור קטן יותר ולהניח אותו במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. עד לשימוש נוסף, ובכן, זה עתה הראיתי לכם כיצד לבודד גרעיני עצב מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. בעזרת גרעינים אלה תוכלו לבצע מספר ניתוחים שונים כגון משקעים חיסוניים של כרומטין.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור תמיד לשמור את הדגימות שלך על קרח מכיוון שהגרעין אינו מקובע ויכול להתפרק בטמפרטורה ארוכה. כמו כן, חשוב לטפל ברקמות אנושיות ברמת בטיחות ביולוגית שתיים ומעלה. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.