גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

על מנת לחקור את האינטראקציות של ה-DNA והכרומטין השולטות בביטוי גנים ספציפי לנוירונים במוח האנושי, יש להשיג תחילה אוכלוסייה טהורה של גרעיני נוירונים. רקמה של מוח אנושי לאחר המוות עוברת הומוגניזציה, וכלל הגרעינים מבודלים באמצעות סבוב (centrifugation) במדרג צפיפות. לאחר מכן, הגרעינים מסומנים עם נוגדנים ספציפיים לנוירונים ומבודלים באמצעות מיון פלוומטרי (flow metric sorting), ובסיום מרוכזים באמצעות אולטרסנטריפוגה.

שלום, אני אניש מאטן מהמעבדה של ד"ר שרון מקבאריאן כאן במחלקה לפסיכיאטריה של בית הספר לרפואה באוניברסיטת מסצ'וסטס. היום אדגים לכם פרוצדורה לבידוד גרעיני נוירונים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. אז בואו נתחיל.

עבור כל דגימת גרעינים המיועדת למיון, התחילו עם אלף מיליגרם של רקמת מוח קפואה לאחר המוות. מכמות זו ניתן להפיק כ-5 מיליון גרעיני נוירונים לאחר מיון מופעל פלואורסצנציה. כדי להתחיל את הפקת הגרעינים, העבירו 250 מיליגרם של רקמת מוח למבחנה המכילה חמישה מיליליטר של lysis buffer, והניחו אותה על קרח.

ברגע שהרקמה מפשירה, יש להעבירה לתהליך הומוגניזציה למשך דקה אחת על קרח. לאחר מכן, העבירו את הרקמה ההומוגנית לשפופרת אולטרה-צנטריפוגה שקופה של 15 ml והניחו את השפופרת על קרח. חזרו על תהליך הומוגניזציה זה עבור שאר הרקמה.

בשלב הבא, העבירו בזהירות באמצעות פיפט 9 ml של תמיסת סוכרוז לתחתית מבחנות האולטרה-צנטריפוגה כדי ליצור מדרג ריכוזים, כך שתמיסת הרקמה ההומוגניזית תהיה מעל תמיסת הסוכרוז. כעת שקלו את מבחנות האולטרה-צנטריפוגה כדי להבטיח שהן מאוזנות במהלך האולטרה-צנטריפוגציה. בצעו התאמות למשקל על ידי הוספת בופר ליזיס לשכבה העליונה. לאחר שקילת המבחנות, הניחו אותן באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור SW 28, וסובבו את הדגימות ב-107163.6 RCF למשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 4 °C.

בסיום הסריבגציה, שאבו את העליון (snat) וכן את שכבת השאריות שנמצאת במדרג הריכוזים. היזהרו לא להפריע למשקע בתחתית המבחנה, המכיל את הגרעינים. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של 1X PBS לכל משקע והניחו לו לנוח על קרח למשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, השעה מחדש את המשקעים על ידי פיפוט למעלה ולמטה. הדגירה על קרח מאפשרת למשקעים להתמוסס מעט מעצמם, מה שמקל על השעיה מחדש של הגרעינים, ובכך מפחית את רמת העקה שעוברים הגרעינים. לאחר מכן, העבר את התרחיף והגרעינים למבחנות צנטריפוגה של 2 מיליליטר.

העבירו את תמיסת החומצות הגרעיניות משתי מבחנות העל-צנטריפוגה לכל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה, והניחו שוב את הדגימות על קרח. כעת, לאחר שהסกัด של החומצות הגרעיניות הושלם, אעבור לשלב הצביעה האימונוהיסטוכימית על מנת לבודד גרעיני נוירונים באמצעות מיון (FACS). את הדגימה המכילה גרעינים ידגרו עם תערובת צביעה אימונוהיסטוכימית המורכבת מנוגדן ראשוני ונוגדן משני, וכן חומרי חסימה. להכנת תערובת הצביעה האימונוהיסטוכימית, ערבבו 1.2 µL של נוגדן ספציפי לנוירונים NeuN לתוך 300 µL של 1X PBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תערובת חסימה, המכילה 0.5% BSA ו-10% סרום עכבר נורמלי ב-1X PBS.

לבסוף, הוסיפו מיקרוליטר אחד של הנוגדן המשני הנקרא LOR 4 88. הכינו בנוסף צביעה אימונוהיסטוכימית עבור דגימת ביקורת שלילית עבור תערובת צביעה זו. השמיטו את הנוגדן הראשוני והחליפו אותו ב-1.2 מיקרוליטר של 1X PBS.

כעת ערבבו במערבל (vortex) את תערובות הצביעה האימונוהיסטוכימית והדגירו אותן למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך בזמן שהתערובות נדגרות. הכינו את דגימות הגרעינים עבור דגימת הביקורת השלילית על ידי העברת 20 µL של תמיסת הגרעינים למבחנה של 2 mL המכילה 980 µL של 1X PBS. הכינו בנוסף ביקורת ללא צביעה, המכילה את תמיסת הגרעינים ו-PBS בלבד.

כעת העבירו 20 microliters של הגרעינים למבחנה אחרת והביאו את הנפח בחזרה ל-1 mil באמצעות 1XPBS. לאחר מכן, החזירו את כל הדגימות לקרח. בשלב זה תערובות הצביעה האימונולוגית מוכנות.

במהלך הדגירה, הוסף 401 µL מהתערובת לדגימה המתאימה. לדגימת הגרעינים הוספה התערובת המכילה הן את הנוגדן החדש והן את LOR 4 88. לדגימת הביקורת השלילית הוספה תערובת המכילה רק את הנוגדן המשני LOR 4 88, בעוד שאל דגימת ביקורת ללא צבע לא הוסף צביעה אימונולוגית.

בשלב הבא, העבירו את הדגימות לרוטטור (coldron) וסובבו אותן בחושך למשך 45 דקות. כעת, לאחר שהדגירה של 45 דקות הסתיימה, אעביר את הדגימות למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס לצורך מיון מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated sorting). במהלך ההובלה למתקן הליבה, יש לשמור את הדגימות על קרח ובחושך. במתקן הליבה לציטומטריית זרימה, הדגימות מסוננות תחילה דרך מסנן של 40 מיקרון ולאחר מכן הן מועברות במכשיר למשך מספר דקות תוך שמירה על טמפרטורה קרה.

פעולה זו מבוצעת כדי להשיג נתונים ראשוניים לפני המיון. הבקרה ללא צביעה קובעת את רמת הפלואורסצנציה השלילית. בהתבסס על מידע זה, יש להתאים את רגישות המכשיר לפלואורסצנציה.

הביקורת הצבועה משמשת כביקורת לפלואורסצנציה. כל רעש רקע הנובע מפלואורסצנציה בנקודה זו קובע את השערים המתאימים הדרושים למיון. מספר שערים שונים משמשים למיון הדגימות.

להלן נתונים טיפוסיים עבור השער הראשון. תרשים ניתוח ה-fax זה מציג דגימה מייצגת לאחר התאמת השער. השער הראשון מזהה תבניות של פסולת וגרעינים חיוניים בהתבסס על שילוב של הגדרות כגון פלואורסצנציה וניסיון ויזואלי כללי.

ציר ה-x מייצג פיזור קדימה (forward scatter), המתאים לגודל יחסי, בעוד שציר ה-y מייצג פיזור צדי (side scatter), המשקף מורכבות פנימית כגון גרנולריות. השער (gate) הראשון יכול לספק גם מושג לגבי גודלם של הגרעינים השונים שנמצאו בדגימה שלנו. הדבר מאפשר להפריד בין השאריות (debris) לבין הגרעינים עצמם, ולהלן נתונים טיפוסיים מהשער השני.

תרשים פקס זה מציג דוגמה לשער שני, המאפשר למיין גרעינים באופן פרטני תוך השמטת אגרגטים. שער זה בוחן הבדלים באורך הזמן שנדרש לגרעינים כדי לעבור דרך הלייזר. אלו שהם אגרגטים לוקחים בדרך כלל זמן רב יותר למעבר.

פרמטר זה חשוב מאוד, שכן הכללה של צברים עלולה להפריע לדיוק בבדיקת הניקיון, כיוון שגרעינים פלואורסצנטיים מסוימים עשויים להיות קשורים לגרעינים שאינם פלואורסצנטיים. לבסוף, להלן נתונים טיפוסיים מהשער השלישי. שער זה מוגדר לאורך גל פלואורסצנציה ספציפי התואם לזה של הפלואורופור שנמצא בנוגדן המשני שלנו.

בתרשים זה, ניתן לראות את רמת הפלואורסצנציה לאורך ציר ה-x ואת גלאי ערוץ אדום עמוק, PECY שבע, לאורך ציר ה-y. נקודות אלו (dot blots) מספקות המחשה ויזואלית טובה יותר בהשוואה להיסטוגרמה של צבע בודד. שימוש ב-SCADA מאפשר למיין ולהפריד גרעינים עצביים חיוביים מגרעינים לא-עצביים שליליים.

לאחר בחירת כל השערים, הגרעינים מומיינים לתוך XPBS אחד. ברגע שכל הדגימה עברה את תהליך המיון, יש לבדוק את טוהר המיון על ידי הרצת Eloqua של הדגימה המומיינת במכשיר. להלן דוגמה לתוצאה אופטימלית.

כאן השוו את דגימת טרום-המיון, המכילה אוכלוסייה מעורבת של גרעינים, ל-Eloqua הממוין, שבו רוב הגרעינים השליליים הוסרו. שימו לב כי אחוזי הטוהר מבוססים על מספר האירועים המזהמים את הדגימה בהתאם לשערים (gates) שהוגדרו. קחו בחשבון שבפעם הראשונה שהדגימה עוברת במכונה, עשוי להתרחש הבהרה (bleaching) מסוימת, מה שיגרום להחלשה של האות; כדי להתחשב בכך, ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות מסוימות.

לאחר מיון הדגימה, התחל בעיבוד הגרעינים. לשם כך, קח 10 mils מהדגימה הממוינת והוסף שני mils של תמיסת סוכרוז, 50 µL של calcium chloride בריכוז 1 M, ו-30 µL של magnesium acetate בריכוז 1 M. אם נפח הדגימה הממוינת קטן מ-10 mils, הגדל את הנפח ל-10 mils על ידי הוספת 1X PBS או התאם את כמויות החומרים הנוספים בהתאם.

בשלב הבא, הפוך את הדגימה מספר פעמים והנח אותה על קרח למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, סבב את הדגימה בצנטריפוגה עם רוטור swing bucket ב-1,786 RCF למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות. לאחר הצנטריפוגה, שאב בזהירות את supernatant מבלי להפריע למשקע הלבן הנמצא בתחתית המבחנה.

לאחר מכן המיסו את המשקע ב-200 µl מהתמיסה המתאימה הדרושה עבור הניסויים הקודמים. במקרה זה, אנו ממיסים את המשקע בבופר דחיסה (downing buffer) עבור ניסוי השבב הבא. לאחר מכן, השעיקו את המשקע באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting up and down).

בשלב זה, ניתן להעביר את הגרעינים למבחנה קטנה יותר ולהניח אותה במקפיא של 80°C-. עד לשימוש נוסף. ובכן, הרגע הצגתי בפניכם כיצד לבודד גרעיני נוירונים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. עם גרעינים אלו, ניתן לבצע מספר ניתוחים שונים, כגון שיקוע חיסוני של כרומטין.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את הדגימות תמיד על קרח, כיוון שהגרעינים אינם מקובעים ועלולים להישחק בטמפרטורות גבוהות לאורך זמן. כמו כן, חשוב לטפל ברקמה אנושית תחת תקני בטיחות של רמה ביולוגית 2 (biosafety level two) ומעלה. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.