Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור
3 באוקטובר 2008
פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.
במעבדת Dowling, אנו חוקרים את הפיזיולוגיה וההתפתחות של הרשתית בדגי זברה כדי לקבוע האם מוטנטים של דגי זברה שאינם מסוגלים לזהות תנועה יכולים לזהות אור ואינם עיוורים. כדי לעשות זאת, אנו בוחנים את התגובה המוטורית הוויזואלית שלהם, ה-VMR. אנו אוספים דגי זברה כארבעה ימים לאחר ההפריה.
הניחו אותם בלוחיות 96 בארות, הכינו מערך דימוי מתאים, כיילו את תוכנת מעקב הווידאו עם הלוחית, ולאחר מכן עקבו אחר התגובה המוטורית של הדגים בעקבות מעברים מאור לחושך או מחושך לאור, תהליך שאנו מכנים VMR. היי, אני פרידה עמראן מהמעבדה של ג'ון דאולינג ומחלקת הביולוגיה המולקולרית והתאית באוניברסיטת הרווארד.
ואני ג'ייסון ריו. אני מהמעבדה של אלכסנדר שיר, גם היא במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. היום נראה לכם את התגובה המוטורית-חזותית של דגי זברה לעלייה ולירידה בעוצמת האור.
אם כן, נתחיל. כדי להתחיל את בדיקת התגובה המוטורית-חזותית, ראשית גדלו זחלי דגי זברה מסוג wild type תחת מחזור אור-חושך בטמפרטורה של 28 °C עד לפחות ארבעה ימים לאחר ההפריה. לצורך השגת התוצאות ההתנהגותיות הטובות ביותר, מחזור האור-חושך הטיפוסי שלנו הוא 14 שעות של אור החל מהשעה 9:00 בבוקר ו-10 שעות של חושך החל מהשעה 11:00 בלילה.
הימנעו מצפיפות יתר של הזחלים. בדרך כלל אנו שומרים לא יותר מ-50 זחלים בצלחת פטרי בודדת. חמישה ימים לאחר ההפריה, אנו מעבירים את דגי הזברה לפלטת 96 בארות עם נפח בארה של 650 µL כדי לספק לזחלים מרחב שחייה רב.
העבירו בעדינות זחל אחד לכל באער באמצעות פיפטת העברה פלסטית. לאחר העברת הדגים לבאערים, מלאו כל באער בכמות מספקת של מי דגים כך שפני השטח של המים יהיו כמעט גבולים לקצה הבאער. הקפידו לא למלא את הבאערים יותר מדי או פחות מדי כדי למנוע בעיות אופטיות במצלמת ההקלטה.
כמו כן, יש להקפיד לא להחדיר בועות לתוך הבארות. הדגים מוכנים כעת למעקב אחר התגובות המוטוריות שלהם לאור ולחושך. נעביר את דגי הזברה בלוחית אל מכשיר ההקלטה.
כעת נמשיך בסקירה של מכשיר ההקלטה. פלטת 96 הבארים המכילה את הדגים תמוקם בתוך תא ההקלטה כאן, במגש הלבן הזה, ותיקבע במקומה באמצעות קפיץ או גומייה. המצלמה ממוקמת בחלק האחורי של התיבה כאן, והיא ממוקדת בפלטה באמצעות מראות בחלק העליון של התיבה הממוקמות כאן.
ניתן לכוונן את זווית המראות הללו על ידי סיבוב הברגים המחזיקים אותן במקומן. תא ההקלטה מואר מלמטה על ידי נורות LED אינפרא-אדומות. הדבר מאפשר למצלמה להקליט את הדגים גם בחשיכה.
הזחלים אינם יכולים לזהות אור IR, ולכן תאורת IR קבועה זו אינה משפיעה על הניסוי. נורות LED לבנות מאירות בנוסף את תא ההקלטה מלמטה. הן נשלטות בנפרד מנורות ה-IR עבור ניסויים שנמשכים יותר ממספר שעות.
ניתן למלא את התא במים זורמים בעדינות כדי לסייע בשמירה על טמפרטורה קבועה לאורך משך הניסוי. המים נשאבים ממאגר באמצעות משאבת אקווריום קטנה ומחוממים ל-28 °C באמצעות מחמם אקווריום תת-מימי סטנדרטי. המים מתנקזים דרך חור ניקוז גדול ומוזרמים חזרה למאגר כדי למזער רעידות מקריות מהחדר.
יחידת ההקלטה כולה מונחת על שולחן מאזניים כבד. כאשר מי apparatus ההקלטה מוכן, משתמשים במכסה של קופסה כדי לכסות את בעלי החיים ולבודד אותם עוד יותר מאור. כעת נמשיך בכיול של ה-96.
הנח את פלטת הבארות עם רשת המחשב של תוכנת המעקב בווידאו במיקומה הראשוני, את פלטת 96 הבארות המכילה את הדגים לתוך תא ההקלטה. בעת שימוש במקלח מים לניסויים ארוכי טווח, הנח את הפלטה במים באיטיות, כדי לאפשר למפלס המים להתייצב מבלי שיישפכו על הפלטה. בתוכנת המעקב בווידאו Viewpoint, ודא שכל הזחלים והניסוי נראים על מסך המחשב.
באמצעות בקרות התוכנה, יישרו את הגריד של תוכנת מעקב הווידאו עם בארות פלטת ה-96 בארות, כך שכל דג יימצא בתוך ריבוע של הגריד. שלב זה חשוב מאוד עבור כל ההקלטות שלכם. מחשב המעקב יחשב את התנועה בנפרד עבור כל אחד מהריבועים הללו.
לפיכך, אם רשת המחשב לא תהיה מיושרת כראוי, חלק מתנועות הדגים עלולות ללכת לאיבוד, או גרוע מכך: שני דגים סמוכים יתפסו את אותו האזור ויספרו כדג אחד לאחר היישור. התזמון להדלקה וכיבוי של האורות מתוכנת במחשב.
בדרך כלל אנו מאפשרים שלוש שעות של הסתגלות לחושך קל בתוך הקופסה. פעולה זו לא רק מאפשרת להשיג רמת פעילות בסיסית, אלא גם מעניקה לזחלים הזדמנות להירגע לאחר הפעולות של הפיפטינג והטיפול. לאחר מכן, אנו סוגרים את דלת תא ההקלטה ומתחילים בהקלטה.
בפועל, אנו מתעדים את הפעילות של כל דג לשנייה, אך תוכנת ה-viewpoint מתעדת למעשה את הנתונים פריים אחר פריים. כאן למטה על המסך ניתן לראות עקב בזמן אמת של דג בודד. במונחים של תנועת פיקסלים, הקו הלבן מציין כי מספר שינויי הפיקסלים הוא מתחת לסף שהוגדר, והקו הירוק מציין כי שינוי הפיקסלים הוא מעל הגדרת הסף.
ערך הסף יהיה תלוי במידת מה במצלמה ובסידור התאורה הספציפיים שלך. עבור הסידור שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל בסף של ארבעה פיקסלים. כלומר, אם פחות מארבעה פיקסלים משתנים, הדבר נחשב לרקע.
אם יותר מארבעה פיקסלים נעים, הדבר מעיד על כך שהדג זז. קבענו באופן אמפירי כי סף זה מזהה כמעט את כל תנועות השחייה והסיבוב של הזחלים. למרות שתיבות ההקלטה מבודדות את הזחלים היטב, אנו עדיין מכבים את האור בחדר ומקפידים למזער הפרעות של רעש מכני, כגון סגירה ופתיחה של דלתות בחדר, קיום מסיבת ריקודים או ביצוע שגרת אימונים גופניים.
לאחר השלמת הניסוי, העבירו את הנתונים שנאספו לגיליון Excel או לחבילת הניתוח המועדפת עליכם. כך נראים הנתונים. הם כוללים את הזמן בשניות מתחילת הניסוי ואת הפעילות של כל זחל בכל שנייה.
כאן מוצג גרף המראה את הפעילות של זחל בודד לאורך כל משך הניסוי, כאשר מספר תגובות הפעלה (on) וכיבוי (off) מסומנות על ידי החיצים בגרף. גרף זה מראה את הפעילות הממוצעת של 40 דגים לאורך כל משך הניסוי, עם מספר תגובות הפעלה וכיבוי כפי שמסומן על ידי החיצים. כפי שניתן לראות, תגובות ההפעלה והכיבוי הן בולטות ועקביות.
ניתן לבצע ניסוי תגובה מוטורית חזותית זה גם בדגי מוטציה. במחקרים אלו, אנו מניחים בדרך כלל דגי פרא (wild type) ודגי מוטציה על אותה פלטה בתבנית של לוח שחמט למטרות בקרה אופטימלית. בעת שימוש בדגי מוטציה על אותה פלטה שבה נמצאים דגי פרא, ודאו שאתם רושמים איזה סוג של דג הונח בכל באר.
להלן הצעה כיצד לעקוב אחר הדגים שהוצבו בכל מבחנה. ובכן, אלו הן תוצאות התגובה המוטורית החזותית, המשוות בין זחלים מסוג בר (wild type) לזחלים מוטנטים. שוב, אנו רואים תגובות הפעלה וכיבוי בולטות ועקביות של זחלי ה-wild type.
עם זאת, זחלי מוטנט ה-chalk, שבהם חסר התפתחות של העין, אינם מגבירים באופן משמעותי את פעילותם בתגובה לעלייה או לירידה בעוצמת האור, ומציגים רמה בסיסית נמוכה של פעילות. תוצאות אלו משוות תגובות של טיפוס בר (wild type) למוטנטים מסוג NO OKR, הנקראים גם מוטנטים מסוג NRC. על בסיס מבחן ה-OKR, סברו כי מוטנט ה-NRC הוא עיוור לחלוטין.
באמצעות בדיקת ה-VMR, אנו מדגימים כי למוטציית ה-NRC יש תגובת off נורמלית ותגובת on מושהית ואיטית. לפיכך, מוטציית ה-NRC אינה עיוורת לחלוטין כפי שחשבו בעבר. הרגע הצגנו בפניכם את התגובה המוטורית-חזותית של דגי זברה מסוג labate לעלייה ולירידה בעוצמת האור.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את הניסוי במהלך היום, מכיוון שדגים פעילים יותר ומגיבים לשינויים בעוצמת האור במהלך היום מאשר במהלך הלילה. זהו כל השלב.
תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התגובה הוויזואלית-מוטורית (VMR) של זחלי zebrafish לשינויים בתאורה, תוך התמקדות מיוחדת במוטנטים עם פגמים בראייה. מטרת המחקר היא להבהיר את היכולות הוויזואליות של מוטנטים של zebrafish שנחשבו בעבר לעיוורים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התנהגותית
- מדע הראייה
רקע
- דגי זברה משמשים בדרך כלל במחקרי ראייה בשל העובריים השקיפים וההתפתחות המהירה שלהם.
- הבנת התגובות החזותיות בדגי זברה יכולה לספק תובנות לגבי ראיית חולייתנים.
- מחקרים קודמים העלו כי למוטנטים מסוימים של דגי זברה חסרה היכולת לזהות תנועה.
- התגובה החזותית-מוטורית (VMR) היא בדיקה מרכזית להערכת יכולות חזותיות.
מטרת המחקר
- לכימות הפלט המוטורי של זחלי דג הזבראי בתגובה לעליות וירידות בעוצמת האור.
- להערכת היכולות החזותיות של מוטציות בדג הזבראי, ובמיוחד מוטציות מסוג no optokinetic response (nrc).
- לקביעה האם מוטציות אלו מסוגלות לזהות אור למרות שסווגו כעיוורות בבדיקות אחרות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף דגי zebrafish ארבעה ימים לאחר ההפריה.
- שימוש בלוחיות 96 בארות למעקב אחר תגובות מוטוריות.
- הטמעת תוכנה למעקב וידאו לצורך ניתוח VMR.
- הערכה של תגובות מוטוריות בעקבות מעברים בין אור לחושך.
תוצאות עיקריות
- בדיקת VMR מכמתת בהצלחה את התפוקה המוטורית של דגי זברה בתגובה לשינויים באור.
- הממצאים מעידים כי מוטציות nrc עשויות שלא להיות עיוורות לחלוטין כפי שחשבו בעבר.
- המחקר מספק תובנות חדשות לגבי היכולות החזותיות של מוטציות בדגי זברה.
- התוצאות מרמזות על פוטנציאל למחקר נוסף של מנגנוני הראייה בחוליתיים.
מסקנות
- ה-VMR הוא כלי יעיל להערכת תגובות חזותיות בדגי zebrafish.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את היכולות החזותיות של מוטציות אחרות של zebrafish.
- מחקר זה תורם להבנת הראייה והמנגנונים העומדים בבסיסה בחוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת התגובה המוטורית החזותית (VMR) מספקת שיטה כמותית בעלת תפוקה גבוהה להערכת תגובות התנהגותיות המונעות מעוצמת אור בזחלי דגי זברפיש, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית של מטרות במסלול החזותי בשלבים מוקדמים של הגילוי. על ידי הבחנה בין תפקודים חזותיים התלויים בתנועה לבין כאלה התלויים באור, הבדיקה תומכת באימות מטרות ובסריקה פנוטיפית של תרכובות המודולות פוטוטרנסדוקציה או סיגנלינג רשתי. האוטומציה שלה והתאימות שלה לפורמטים של 96 בארות משפרות את ההדירות והיכולת להרחבה (scalability) לצורך מיון מטרות פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי בידול בין מסלולי ראיית תנועה (OKR) לראיית עוצמת אור (VMR) בדגי zebrafish.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של גנים בתהליכי פוטוטרנסדוקציה תוך שימוש במדדי תנועה כסמנים לתגובתיות חזותית.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מוטנטים בעלי יכולת גילוי אור שיורית למרות עיוורון במבחנים מבוססי תנועה, ובכך מפחית מסקנות שגויות של תוצאות שליליות במטרות הנחקרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקה ברחבה גבוהה של תרכובות המשפיעות על תגובות התנהגותיות המונעות על ידי אור.
- פלט כמותי: יצירת נתוני פעילות לוקומטורית ברזולוציית שניות, המאפשרים ניתוח תגובה למינון וקביעת EC50.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מעקב וידאו אוטומטי בלוחות של 96 בארות מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של ספריות גנטיות או כימיות עם שונות מינימלית בין הבארות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדלים ליקויים חזותיים מולדים שבהם התפתחות הרשתית תקינה אך דינמיקת התגובה לאור משובשת, דבר הרלוונטי לדיסטרופיות של הרשתית.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין פנוטיפים התנהגותיים של דגי זברה לבדיקות תפקוד חזותי ביונקים באמצעות מנגנוני פוטוטרנסדוקציה שמורים.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר זיהוי מוקדם של תרכובות המצילו את התגובתיות עם תחילת חשיפה לאור במוטנטים של nrc, ובכך תומך בהחלטות go/no-go בפיתוח תרופות חזותיות בשלב הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת ה-VMR משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד עבור מודולטורים של המסלול הראייתי, על ידי אספקת קריאה פונקציונלית, in vivo, של רגישות הרשתית לאור לפני מחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי גנים המעורבים בזיהוי אור, ללא תלות בראיית תנועה, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה במסלולי איתות חזותיים.
- סריקה: מספק תוצרי תנועה של דגי זבב (zebrafish) הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, המתאימים לסריקת ספריות המכוונות לתהליכי פוטוטרנסדוקציה או לתגובות אור מחזוריות (circadian).
- אנליזה: מספק מדידות פעילות בעלות רזולוציית זמן (קינטיקה של תגובת ON/OFF, אמפליטוד שיא, חזרה לבסיס), המאפשרות ניתוח השוואתי בין גנוטיפים או תנאי טיפול שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של VMR בזבב בשלב הזחלים למודלים פרה-קליניים של תפקוד רשתית שבהם עיבוד קלט האור פגום.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה התנהגותית אוטומטית וניתנת לשימוש חוזר להערכה של מודולטורים של המערכת החזותית בפרויקטים שונים ובתחומי טיפול מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי פתרון עמימות מכניסטית בין מסלולי ראיית תנועה וראיית אור.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מעקב וידאו אוטומטי ותנאים סביבתיים מבוקרים (28°C, תאורת IR).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות של go/no-go על ידי זיהוי תרכובות המווסתות התנהגות התגובה לאור, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים בפיתוח טיפולים ויזואליים.
- השפעה על תיק הפרויקטים: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על הצלה ויזואלית פונקציונלית במודלים של עיוורון, ובכך משפר את הקצאת ההון בתיקי פרויקטים של מדעי העצבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי זבראפיש (zebrafish), קביעת שלבים התפתחותיים ותכנון בדיקות התנהגותיות.
- תלוי בתוכנת מעקב וידאו, במערכות דימוי בעלות יכולת אינפרא-אדומה ובחומרת בקרה תכנותית של תאורה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של טעינת פלטות בארות, הגדרות סף ותזמון מעברים של תאורה לצורך הדירות בין מעבדות.
- חייב להביא בחשבון השפעות צירקדיאניות, שכן התגובה של הזחלים לשינויי תאורה משתנה בהתאם לשעה ביום.
- מוגבל לזיהוי תגובות מוטוריות גסות; אינו מאפשר ניתוח של עיבוד חזותי ברמת המעגלים או התת-תאי ללא אלקטרופיזיולוגיה משלימה.
