ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

סרטון זה מדגים פרוטוקול למשקעים חיסוניים או מפגש של DNA שעבר מתילציה. שיטה המשמשת לבידוד ספציפי של DNA שעבר מתילציה בצורה בלתי מוטה. מתילציה של DNA ביונקים מאופיינת בתוספת של קבוצת מתיל למצב C חמש של ציטוזין.

כאשר הוא קיים בדינוקלאוטיד CPG, זהו סימן אפיגנטי הפיך הממלא תפקיד חשוב בהתפתחות תקינה, כמו גם במספר תהליכי מחלה. פונקציות נורמליות של מתילציה של DNA כוללות השבתת כרומוזום X בנקבות, השתקת אלמנטים חוזרים, הטבעה גנומית ושמירה על יציבות גנומית. מתילציה של DNA הוכחה גם כממלאת תפקיד במחלות רבות כגון סרטן, תסמונת דר וילי, תסמונת אנגלמן, וכשל חיסוני, חוסר יציבות מריק צנטרי ותסמונת אנומליה בפנים.

בסרטן, למשל, היפרמתילציה ומקדמים חריגים עלולים לגרום להשתקה של גנים מדכאי גידול חיוניים. בעוד שהיפומתילציה לא נכונה גורמת לחוסר יציבות כרומוזומלית והפעלת אונקוגנים מושגת על ידי החלקה קולית ראשונה של DNA לשברים בגודל של 300 עד 1000 זוגות בסיסים. לאחר מכן ה-DNA הסוניקטיבי עובר דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס.

נוגדנים ראשוניים, המזהים חמישה מתאזין ראשוניים מתווספים ומאפשרים להם לקשור מקטעי DNA שעברו מתילציה נוגדנים משניים, מצומדים לחרוזי דינה מגנטיים משמשים לבידוד שברי DNA, שנקשרו על ידי הנוגדן הראשוני. שברים לא מתיליים מוסרים והנוגדנים מתעכלים על ידי פרוטאינאז.

ניקוי KA פניל כלורופורם מסיר את החלבון המעוכל והמשקעים מטהרים את ה-DNA, המועשר כעת עבור מקטעים שעברו מתילציה. מפגש, DNA עשוי לשמש ליישומים כגון מיקרו-מערך PCR וריצוף. המפגש מבוצע בדרך כלל כהליך של יומיים.

היום הראשון כולל הכנת DNA, סוניקציה, משקעים חיסוניים ועיכול חלבונים. היום השני כולל מיצוי pH כלורופורם ומשקעי אתנול כדי לטהר ולבודד את ה-DNA המועשר למתילציה. ישנם כמה חומרים מיוחדים הנדרשים למפגש, כולל צינורות צנטריפוגה מסיליקון, מכשיר שיזוף DNA, נוגדן ראשוני, עכבר אנטי חמישה מתאזין ראשוני, נוגדן חד שבטי, נוגדן משני, חרוזי דינה, מצומדים לכבשים, אנטי US IgG ומתלה צינור מגנטי.

השלב הראשון בפרוטוקול המפגש הוא הכנת ה-DNA. חובה להעריך את אופי ה-DNA מראש. נדרשת ידיעת מצב ה-DNA של הדגימה, האם היא בעיקר כפולה או חד-גדילית, שכן כימות מדויק של הדגימה הוא בעל חשיבות עליונה ושיטות שונות לקביעת כמות ה-DNA עלולות להיות מושפעות לרעה מנוכחותם של מיני DNA לא רצויים.

ניתן להעריך בקלות את כמות ה-DNA הדו-גדילי על ידי פוטומטריה ספקטרלית באמצעות NanoDrop 3, עומס 300 nd 1.5 מיקרוליטר ולהגדיר את סוג המדידה לחומצת גרעין, לבחור DNA 50 כחישוב ולאתחל את המכשיר עם 1.5 מיקרוליטר מים. נקה את הכן ורוקן את המכשיר עם 1.5 מיקרוליטר מהנוזל. הדגימה מומסת בנקי, הכן טוען 1.5 מיקרוליטר מהדגימה ומדד פגיעה.

הריכוז יינתן וניתן להשתמש בו. כדי לחשב את מספר המיקרוליטרים הדרושים לי, טבל יחס A שניים 60 לשניים 80 של 1.8 אידיאלי כאן. מכינים דגימה של מיקרוגרם אחד.

עם זאת, דגימה של עד 200 ננוגרם מספיקה כדי להשיג תוצאות מוצלחות. לפגישה, טען את דגימת ה-DNA לתוך צינור סיליקון נקי. הוסף מספיק מים סטריליים כדי להביא את הנפח הסופי ל -50 מיקרוליטר.

סוניקציה של DNA ומשקעים חיסוניים חייבים להתבצע בצינורות סיליקון כדי למנוע קשירה לא ספציפית של DNA וחלבונים לדפנות הצינור. לאחר הכנת ה-DNA, הדגימה חייבת להיות סוניקציה קולית נדרשת כדי לפצל את ה-DNA מכיוון שהחיסון יעיל יותר עם שברי DNA קטנים יותר, טען את הדגימה לתוך הסוניקט, ודא שהגדרת ההספק מוגדרת לגבוהה ושהמכונה מוגדרת ל-30 שניות. בהפסקה של 30 שניות, מלאו את הבסיס לקו המילוי בארבע מעלות צלזיוס מים.

סוניקציה של הדגימה במשך שבע דקות. בסיום הסוניקציה, הסר את הצינור והניח אותו על קרח. חשוב לייעל את תנאי הסוניקציה עבור הדגימה הצפויה שלך, גודל ה-DNA מראש.

לדוגמה, דגימת DNA מושפלת חלקית תדרוש זמן סוניקציה קצר יותר. ניתן לדמיין מוצרי סוניקציה על ידי טכניקות אלקטרופורטיות סטנדרטיות. מקטעי DNA בגודל של 300 עד 1000 זוגות בסיסים רצויים בשלב זה לשימוש מאוחר יותר.

במבחני מיקרו-מערך ו-PCR, עליך לשמור חמישית מה-DNA שלך כדי לשמש כקלט או כ-DNA ייחוס במקרה זה, 800 ננוגרם של DNA סוניקטיבי ישמשו למשקעים החיסוניים והשאר יופרש כ-DNA ייחוס. השלב הבא בפרוטוקול המדיה הוא תגובת אימונו-משקעים או IP לפני הוספת הנוגדן הראשוני, יש לעבור דנטורציה של ה-DNA. דנטורציה נדרשת מכיוון שהנוגדן העיקרי רגיש ל-DNA חד-גדילי.

מניחים את הדגימה באמבט מים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר השלמת שלב הדנטורציה, העבירו מיד את הצינור לקרח למשך חמש דקות לפחות. זה ימנע את הדנטורציה של ה-DNA מרין לכרוע ברך ויאפשר קשירת נוגדנים אופטימלית כאשר הדגימה התקררה.

סובב את הצינור בקצרה כדי למשוך את התוכן לתחתית. לאחר מכן, יש להוסיף את הנוגדן הראשוני. יש לטטר את כמות הנוגדנים המשמשת עבור כל אצווה ועבור כל יצרן.

במקרה זה, אנו מוסיפים חמישה מיקרוגרם של נוגדן ראשוני ולאחר מכן מוסיפים מאגר חיסוני או מאגר IP לנפח סופי של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן, ה-DNA של ה-IP מונח במסובב ומשאיר אותו לדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. סיבוב נדרש כדי למנוע קונגלומרציה של נוגדנים בתוך הצינור במהלך הדגירה.

כרבע שעה לפני השלמת הדגירה הראשונית של הנוגדנים, נקו והכינו את חרוזי הדינה המגנטיים. ראשית, השעו ביסודיות את החרוזים בבקבוקון על ידי מערבולת. לאחר מכן העבירו 30 מיקרוליטר חרוזים לצינור סיליקון נקי והניחו את הצינור הזה על מתלה מגנטי לתגובות מרובות.

העבירו 30 מיקרוליטר חרוזים לכל תגובה, בתוספת מספיק לתגובה אחת נוספת כדי לאפשר שגיאת פיפטינג או אובדן לא מכוון של כמה חרוזים. למשל, לשמונה תגובות. הסר מספיק חרוזים לתשע תגובות או 270 מיקרוליטר.

החרוזים המגנטיים יימשכו לעבר דופן המתלה המגנטי. אפשר שתי דקות לחרוזים לנדוד ולהתייצב לפס מוגדר על קיר הצינור. לאחר מכן, הסר והשליך את הפיפטה העליונה בזהירות והקפד להימנע מהפרעה לחרוזים על הקיר האחורי עם קצה הפיפטה.

החלף את הסופרנטנט בנפח עודף של מערבולת מאגר IP והחזר אותו למתלה המגנטי למשך שתי דקות. חזור על הכביסה הזו פעם נוספת והשהה מחדש את חרוזי הכביסה בנפח המקורי של מאגר ה-IP שלהם. אחזר את צינור הדגימה מהמסובב בסיום הדגירה.

כדי להשלים את המשקעים החיסוניים, הוסיפו 30 מיקרוליטר של חרוזים נקיים לתגובה והחזירו את הצינור למסובב למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה הזו, הנוגדן המשני, שהוא אנטי IgG של עכבר, ייקשר לנוגדנים העיקריים של העכבר. הנוגדנים נגד העכבר מצומדים לחרוזי דינה מגנטיים, מה שמאפשר התאוששות קלה של המוצרים הקשורים ושלב הטיהור שאחריו.

לאחר השלמת הדגירה עם שני הנוגדנים, הנח את צינור ה-IP על המדף המגנטי למשך שתי דקות. בשלב זה, ה-DNA שעבר מתילציה יהיה קשור על ידי הנוגדן הראשוני, שבעצמו יהיה קשור על ידי הנוגדן המשני המצומד של חרוז הדינה. הסר והשליך את הסופרנטנט והחלף אותו ב-500 מיקרוליטר של מאגר IP.

מערבבים את תכולת הצינור ומניחים אותו בחזרה על המדף למשך שתי דקות. חזור על שטיפה זו עם מאגר IP פעם נוספת. לאחר הוצאת הסופרנטנט מה-Resus הכביסה האחרונה, השעו את החרוזים בפעם האחרונה.

ב -400 מיקרוליטר של חיץ עיכול, טפל בתגובה עם 100 מיקרוגרם של פרוטאינאז K ודגירה למשך הלילה ב -50 מעלות צלזיוס. הטיפול בפרוטאינאז K נחוץ לעיכול חלבוני הנוגדנים וכל חלבון שיורי הקשור ל-DNA, ומאפשר לשחרר את ה-DNA המתילי לתמיסה. טיהור ה- DNA מתבצע ביום השני להליך המפגש, אחזר את צינור העיכול מהחממה.

במכסה אדים, הוסף 500 מיקרוליטר של פנו-כלורופורם אחד לאחד ב-pH 7 לצינור ומערבולת היטב סובב את הצינור במשך 10 דקות ב-13,000. ז. הסר בזהירות את השלב המימי העליון מהצינור מבלי להפריע לממשק או להסיר אף אחת מהשכבה האורגנית. העבירו את השלב המימי לצינור חדש.

חילוץ שני עשוי להתבצע אם הממשק נראה מעונן. לאחר מכן, הוסף נפח עשירי אחד של שלושה נתרן אצטט מולארי במקרה זה, 40 מיקרוליטר. ניתן להשתמש במיקרוליטר אחד של גליקוגן כנשא כדי להקל על ניקוי הגלולות.

מערבל את הצינור כדי לערבב את התוכן. לאחר מכן מוסיפים שני נפחים של 100% אתנול, מערבולת ומקפיאים במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לאחר ההקפאה. הדנ"א המשקע מסובב בצנטריפוגה בטמפרטורה של 13,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

כדור DNA ייווצר בתחתית הצינור. הוציאו את הצינור מהצנטריפוגה והוציאו את האתנול. היזהר לא להפריע לכדור בתחתית הצינור.

ייתכן שיהיה צורך בסיבוב דופק כדי להסיר שאריות אתנול. כדי לשטוף את הגלולה, הוסיפו 500 מיקרוליטר מערבולת אתנול קרה, 70%, וסובבו שוב במשך 20 דקות בחום של 13, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הסיבוב השני, הסר את סיבוב דופק האתנול של 70% והסר את שאריות האתנול בעזרת פיפטה.

השאירו את הצינור על מתלה כשהמכסה פתוח כדי לייבש את הגלולה ולאפשר לאתנול שנותר להתאדות. לבסוף, ראוס משהה את הגלולה המכילה רק DNA מועשר למתילציה ו-10 מיקרוליטרים של מים סטריליים, מה שמאפשר מספיק זמן לכדור ה-DNA להתמוסס לפני השימוש. מומלץ לאמת את מיומנות המפגש על ידי PCR.

ניתן לעשות זאת על ידי הפעלת תגובות PCR שנועדו להגביר מוצרים הממחישים מקטעי DNA מתילציה וללא מתילציה באופן דיפרנציאלי עבור פריימרים רגילים של DNA אנושי. ניתן להשתמש באזור בקרת ההטבעה H 19 בשילוב עם פריימרים שנועדו להגביר אזור בגנום, שאינו עובר מתילציה. דוגמה, ניתן למצוא רצפי פריימר ותנאי מחזור PCR בפרוטוקול הנלווה.

בשלב זה, יש צורך לאחזר את הקלט או ה-DNA הייחוס שהונח בתחילת פרוטוקול המפגש. קבוצה אחת של תגובות PCR תוגדר באמצעות ה-DNA הקלט, והקבוצה השנייה תשתמש ב-IP DNA מועשר למתילציה. אם המפגש הצליח, ה-IP PCR יפיק מוצר באמצעות פריימרים למתילציה ולא מוצר המשתמש בפריימרים הבקרה.

לעומת זאת, ה-PCR הקלט צריך לייצר מוצרים באמצעות שני פריימרים מכיוון שהוא מכיל גם מתילציה וגם לא מתילציה. שברי DNA. DNA מועשר עבור שברים שעברו מתילציה יכול לשמש למספר יישומים במורד הזרם, כגון ריצוף PCR וניתוח מיקרו-מערך.

כאשר הוא משולב עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית אחרות, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את מצב המתילציה של ה-DNA באופן ספציפי ללוקוס או באופן רחב גנום לפרופיל מתילציה או לחקר אפיגנומיקה.