Name: ה-DNA מפוגל immunoprecipitation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: למד את פרוטוקול MeDIP לבידוד DNA מתילצ'ן בצורה לא מוטה. השיטה משתמשת בנוגדנים ספציפיים ל-5-methylcytosine ומאפשרת חקר סימנים אפיגנטיים בפיתוח ובמחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות לחברי בראון לאם מעבדות עבור השתתפותם בביקורת זו וידאו במאמר. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לחקר הבריאות מייקל סמית הקרן לחקר בריאות.

ה-DNA מיצוי הכנת המדגם דנ&quot;א ממגוון רחב של מדגמים שונים (תאים בתרבית, טרי קפוא, כמו גם פורמלין-קבוע רקמות פרפין מוטבע) יכול לשמש MeDIP. חשוב להשתמש DNA מטוהרים ללא חלבונים הקשורים כמו ההיסטונים. חשוב גם כדי להסיר RNA ככל האפשר מן המדגם, כפי שהוא יכול להפריע quantitation הן DNA ו מחייב נוגדנים. כמות ה-DNA המשמש MeDIP יכול לנוע בין 200 ל ng מיקרוגרם 1 בהתאם לכמות ה-DNA זמין. כדי להמחיש זאת בפרוטוקול, 1 מיקרוגרם של ה-DNA ישמשו. פרוטוקול הבאה תספק איכות גבוהה DNA גדילי כפול מתוך תאים בתרבית. פרוטוקולים אחרים צריכים להיות מועסקים להפקת דנ&quot;א מסוגים מדגם אחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μl של חיץ העיכול על גלולה תא צינור Eppendorf 1.7 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מיקרוגרם של proteinase K כדי הצינור, דגירה לילה בשעה 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3 עד 5 פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 מיקרוגרם של RNase A ו דגירה 1 שעות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl פנול pH 7 ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 11 עד 13 פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ומערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח 1/10th 3 נתרן אצטט M (40 μl) ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 כרכים (900 μl) של אתנול 100%, לערבב היטב, מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend-DNA של μl 50 dH2O מעוקרים לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הדנ&quot;א בעזרת ספקטרופוטומטר NanoDrop. 260: 280 יחס של 1.8 הוא אידיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת איכות דנ&quot;א טווח גודל על ג&#39;ל agarose עם סולם 100 נ&quot;ב. משהו כמו 10 ננוגרם של הדנ&quot;א הגנומי ניתן להריץ על 1.7% agarose ג&#39;ל ואחריו מכתים באמצעות צבע כי הוא רגיש מאוד כמויות קטנות של דנ&quot;א כגון זהב SYBR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב הגליל האחד siliconized לפי המדגם, להכין 1 מיקרוגרם של ה-DNA בהיקף כולל של 50 μl עם שאר נפח מורכב עם מעוקרים DH 2 O. </li></ol> ה-DNA SONICATION Sonication דנ&quot;א פרוטוקול MeDIP חייב להתבצע בתוך צינורות siliconzied למנוע מחייב ספציפית של חלבונים שאינם קירות צינור. פעמים sonication אופטימלית עבור דגימות DNA מבוססים על מידת הפיצול דגימת DNA כפי שנקבע מן אלקטרופורזה בג&#39;ל (שלב 27). לדוגמה, ה-DNA המופק תאים בתרבית צריך להיות משקל מולקולרי גבוה מאוד, יהיה בהמשך דורשים sonication יותר DNA שנלקחו דגימות ארכיוני אשר לעתים מושפל חלקית. אם הדגימות של משקל מולקולרי גבוה באופן אחיד, סביר בשלב זה להמשיך עם sonication כמתואר בלי לבדוק כל דגימה בנפרד פרוטוקול זה. אם הדגימות מקוטעת כמו עם דגימות ארכיוני, יהיה צורך להתאים את ההליך sonication סביר ידי הפחתת פעמים sonication להשיג 300-100bp שברים. אם אתה מצפה לתהליך דגימות מפורקים חלקית, אופטימיזציה של הפרמטרים sonication יכול להתבצע על מדגם מייצג מאלה של עניין. בהתבסס על מידת הפיצול DNA שנצפה מן ג&#39;ל אלקטרופורזה (שלב 27), הנסיין יכול לקבוע מראש את הזמן sonication אופטימלית למדגם. כאן אנו מתארים שיטה להשיג שברי 300-1000 bp-DNA על ידי sonication עם מכשיר sonicating אוטומטיות (Bioruptor מ Diagenode, UCD-200 TM) באמצעות משקל מולקולרי גבוה DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים Biorupter חייב להיות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate במשך 7 דקות על הגדרות אוטומטי (30 שניות על 30 שניות ליד כוח מרבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 800 ננוגרם (40 μl) של המוצר במקום sonicated וב siliconized צינור 1.7 מ&quot;ל צנטריפוגות עבור immunoprecipitation (IP) תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד הנותרים 200 ננוגרם (10 μl) לשמש קלט (IN) DNA הפניה (חנות ב 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON של ה-DNA מפוגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל את ה-DNA אשר ישמשו עבור התגובה IP (800 ננוגרם) בשעה 95 ° C במשך 10 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים מיד על הקרח. בואו DNA מגניב לגמרי (כ 5 דקות על קרח) לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 נוגדנים חד שבטיים מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ ה-IP (משמש בטמפרטורת החדר במשך פרוטוקול זה) נפח סופי של μl 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס מסתובב מחזיק צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שלב 5 תושלם, להכין Dynabeads ידי שטיפה (שלבים 6-11). ראשית, resuspend החרוזים ביסודיות על ידי בקבוקון vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 30 μl (~ 2 x 10 7) Dynabeads resuspended לכל תגובה פלוס 1, לתוך צינור siliconized חדש (למשל, אם עושים 8 תגובות, להסיר חרוזים מספיק 9 μl, כלומר 270). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant. בעת הסרת supernatant, אל תיגע חרוזים נגד בתוך הקיר (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך המגנט, ו resuspend החרוזים בנפח עודף של חיץ IP (750 μl-1000 μl). מניחים את הצינור בחזרה על המדף מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעם נוספת, ולאחר מכן resuspend החרוזים שטף במאגר ה-IP בהיקף המקורי הוסר בשלב 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של Dynabeads שטף התגובה לכל IP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של בעל צינור מסתובב עבור 2 שעות על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הושלמה, במקום הצינור על מתלה מגנטי עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את supernatant. הימנע מנגיעה הקיר הפנימי של הצינור (איפה החרוזים למשוך המגנט) עם קצה פיפטה. הוסף 500 μl של חוצץ ה-IP. מערבבים את תכולת שפופרת והחזיר אותו על מתלה מגנטי במשך 2 דקות. חזור על לשטוף עם חיץ 500 IP ul פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant מן לשטוף האחרון, resuspend את החרוזים 400 μl של חיץ העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התגובה עם 100 מיקרוגרם של proteinase K ו דגירה לילה בשעה 50 ° C. </li></ol> טיהור DNA IMMUNOPRECIPITATED <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl pH 01:01 פנול / 7 כלורופורם ו מערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלק מימית (למעלה) אל צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1 עד 3 אם שלבי הביניים בין שכבות מימית ואורגנית מופיע מעוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 10 נפח ה 3 נתרן אצטט M (40 μl) ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של גליקוגן (20 מיקרוגרם / μl) ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 כרכים (1000 μl) של אתנול 100%, וורטקס, ומקום בו -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl 70% אתנול קר לשטוף. בקצרה וורטקס, ואת ספין ב 000 גרם 13 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול 70%, ספין דופק, ולהסיר אתנול שיורי על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר היבש גלולה עם מכסה פתוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל עקבות של אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA גלולה ב μl 10 מעוקרים DH 2 0. </li></ol> אימות BY PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול לבדוק על מנת להבטיח כי הליך MeDIP שלך עובד על ידי ביצוע פרוטוקול MeDIP באמצעות DNA אנושי רגיל (זכר או נקבה), ולאחר מכן assaying אזור ידוע להיות מועשר עבור מתילציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 30% מהתוצר MeDIP אל צינור ה-PCR, ועוד 30% של המוצר MeDIP אל צינור אחר PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 10 ng של IN-DNA לתוך צינור ה-PCR, ו - 10 ננוגרם של IN-DNA לתוך צינור אחר PCR. אתה צריך עכשיו יש ארבעה תגובות נפרדות PCR להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע באמצעות PCR H19 ו CTRL primers כמפורט בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שתי mastermixes (אחד עבור כל קבוצה פריימר) לתגובות PCR עם נפח 12.5 הכולל μl כפי שמתואר בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycle PCR באמצעות התנאים המפורטים בטבלה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה 5 μl של מוצרי ה-PCR על ג&#39;ל agarose 2% עבור להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות הצפויות MeDIP מוצלח מוצגים בלוח 4. </li></ol> טבלאות טבלה 1: H19 ו CTRL primers עבור אימות PCR. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריימר הגדר </td><td> קדימה פריימר </td><td> הפוך פריימר </td><td> מוצר הצפוי גודל </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 נ&quot;ב </td></tr><tr><td> CTRL (שליטה) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 נ&quot;ב </td></tr></tbody></table> טבלה 2. Mastermixes לתגובות PCR. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> H19 מערבבים (לכל Rxn) </td><td> CTRL מערבבים (לכל Rxn) </td></tr><tr><tד&gt; DDH 2 O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10X הצפת </td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTP לערבב (10 mM כל אחת) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 מ&quot;מ) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R או CTRL_F / R) (10 מיקרומטר כל F / R) </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> פלטינום תקי </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> לוח 3. PCR thermocyling תנאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> טבלה 4. תוצאות צפויות PCR עבור MeDIP מוצלח. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> תבנית ה-DNA </td></tr><tr><td> פריימר משמש </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> חיובי </td><td> חיובי </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> חיובי </td><td> שלילי </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

ישנה מודעות הולכת וגוברת של ה-DNA משחק תפקיד משמעותי מתילציה של המחלה, ולכן פיתוח של מבחני למדוד שינוי זה הם הופכים חשובים יותר ויותר 3, 12, 13. הטכניקה MeDIP הוא כלי נוח להקרנה על הגנום כולו, הן לבין מוקד ספציפי ברמה 6, 7. טכניקה זו מספקת תצוגה מהירה של מתילציה רמות ה-DNA באמצעות כמויות מוגבלות של החל דנ&quot;א מאפשר השוואה קלה בין מקורות שונים. יישומים Downstream השימוש במוצר MeDIP כוללים מגוון של microarrays כגון גנום שלם CPG oligonucleotide מערכים אי, ישי...

<table><tbody><tr><td>סוניקטור Biorupter</td><td>כלי</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרוצנטריפוגה SafeSeal בנפח 1.7 מ"ל</td><td>אחר</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר ND 3300</td><td>כלי</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני: Anti-5&amp;rsquo;נוגדן חד-שבטי (mAb) לעכבר נגד methylcytosine-</td><td>ריאגנט</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מבחנות מגנטי</td><td>כלי</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>מיני LabRoller</td><td>כלי</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>בופר IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. נשמר בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>בופר עיכול</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

ה-dna מפוגל immunoprecipitation

Methylated DNA Immunoprecipitation

זיהוי תבניות מתילציה DNA היא הליך שכיח במחקר של אפיגנטיקה, כמו מתילציה ידוע כבעל השפעה משמעותית על ביטוי גנים, והיא מעורבת עם התפתחות המחלה נורמלית, כמו גם<sup&gt; 1-4</sup&gt;. לפיכך, היכולת להבחין בין דנ&quot;א מפוגל ולא מפוגל DNA חיוני ליצירת פרופילים מתילציה של מחקרים כאלה. מפוגל DNA immunoprecipitation (MeDIP) היא טכניקה יעילה להפקת דנ&quot;א מפוגל ממדגם של עניין<sup&gt; 5-7</sup&gt;. מדגם של ng קטנה כמו 200 של ה-DNA הוא מספיק נוגדנים, או immunoprecipitation (IP), התגובה. DNA הוא sonicated לרסיסים הנעים בגודל 300-1000 bp, והוא מחולק immunoprecipitated (IP) קלט (ב) חלקים. ה-DNA הוא ה-IP לאחר מכן חום מפוגל וטופחו אז עם אנטי 5&#39;mC, המאפשר נוגדן חד שבטי כדי לאגד DNA מפוגל. אחרי זה, חרוזים מגנטי המכיל נוגדנים משני עם זיקה הנוגדן העיקרי מתווספים ו מודגרות. אלה חרוז צמודות נוגדנים תחייב את נוגדן חד שבטי השתמשו בשלב הראשון. ה-DNA מורכב חייב את הנוגדן (DNA מפוגל) מופרד משאר הדנ&quot;א באמצעות מגנט למשוך את מתחמי מתוך פתרון. שוטף באמצעות מספר ה-IP חיץ מבוצעות לאחר מכן להסיר את, הלא מאוגד מפוגל DNA. מפוגל ה-DNA / נוגדן מתחמי מתעכלים אז עם proteinase K לעכל את הנוגדנים ומשאיר רק את ה-DNA מפוגל ללא פגע. הדנ&quot;א הוא מועשר מטוהרים על ידי פנול: מיצוי כלורופורם כדי להסיר את החומר חלבון זירז אז resuspended במים לשימוש מאוחר יותר. טכניקות PCR יכול לשמש כדי לאמת את יעילות ההליך MeDIP על ידי ניתוח מוצרי הגברה של IP ו-IN-DNA עבור אזורים הידועים חוסר וידוע מכילים רצפי מפוגל. הדנ&quot;א מפוגל מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מוקד ספציפי (PCR) או הגנום כולו (microarray וסדר) מחקרים מתילציה, והוא שימושי במיוחד כאשר מיושם בשיתוף עם כלי מחקר אחרים, כגון פרופיל גנטי הביטוי הכלאה השוואתי מערך הגנום ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. חקירה נוספת לתוך מתילציה DNA יוביל לגילוי מטרות epigenetic חדש, אשר בתורו, עשוי להיות שימושי בפיתוח כלי מחקר חדש טיפולית או פרוגנוסטיים עבור מחלות כגון סרטן המאופיינים DNA מפוגל aberrantly<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ה-DNA immunoprecipitation מפוגל (MeDIP). MeDIP היא הליך יומיים כי סלקטיבי תמציות שברי DNA מפוגל ממדגם הדנ&quot;א הגנומי באמצעות נוגדנים עם ספציפיות עבור 5-methylcytosine (אנטי 5 MC).

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

זיהוי דפוסי מתילציה של DNA הוא הליך נפוץ בחקר האפיגנטיקה, שכן ידוע כי למתילציה יש השפעות משמעותיות על...

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרה של DNA מתילציה באמצעות שיקוע חיסוני (methylated DNA immunoprecipitation) או meetup. זוהי שיטה המשמשת לבידוד ספציפי של DNA מתילציה באופן לא מוטה. מתילציה של DNA ביונקים מאופיינת בהוספת קבוצת מתיל לעמדה C5 של ציטוזין.כאשר היא מופיעה בדינוקלאוטיד CpG, מדובר בסימן אפיגנטי הפיך המשחק תפקיד חשוב בהתפתחות תקינה, כמו גם במספר תהליכים מחלה. תפקודים תקינים של מתילציה של DNA כוללים השתקה של כרומוזום X בנקבות, השתקה של רצפים חוזרים, הטבעה גנומית ושמירה על יציבות גנומית. כמו כן, הוכח כי למתילציה של DNA יש תפקיד במחלות רבות כגון סרטן, תסמונת דה-וילי, תסמונת אנגלמן, ותסמונת של חסר חיסוני, חוסר יציבות בצנטרומר ואנומליות פנימיות.בסרטנים, למשל, היפרמתילציה חריגה של מקדמים (promoters) עלולה להוביל להשתקת גנים חיוניים למדיקת גידולים. בעוד שהיפומתילציה שגויה גורמת לחוסר יציבות כרומוזומלית ולהפעלה של אונקוגנים, התהליך מבוצע תחילה על ידי סוניקציה של ה-DNA למקטעים שגודלם נע בין 300 ל-1000 זוגות בסיסים. לאחר מכן, ה-DNA שעבר סוניקציה עובר דנטורציה בטמפרטורה של 95 °C.נוספים נוגדנים ראשוניים, המזהים 5-methazine, והם נשארים להיקשר למקטעי DNA מתילתיים. נוגדנים שניוניים, המשורשריים לחרוזים מגנטיים (dyna beads), משמשים לבידוד מקטעי ה-DNA שנקשרו לנוגדן הראשוני. מקטעים שאינם מתילתיים מוסרים, והנוגדנים מעוכלים באמצעות proteinase.ניקוי באמצעות כלורופניל פניל KA מסיר את החלבון שעבר עיכול, והשקיעה מטהרת את ה-DNA, המועשר כעת במקטעים מתילתיים. לאחר מכן, ניתן להשתמש ב-DNA ליישומים כגון PCR microarray וריצוף. התהליך מבוצע בדרך כלל כפרוצדורה של יומיים.היום הראשון כולל הכנת DNA, סוניקציה, שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ועיכול חלבונים. היום השני כולל מיצוי כלורופורם ב-pH מוגדר ושיקוע אתנול כדי לטהר ולבודד את ה-DNA המועשר במתילציה. נדרשים מספר חומרים מיוחדים לביצוע הפרוטוקול, הכוללים מבחנות צנטריפוגה עם סיליקון, מכשיר סוניקציה ל-DNA, נוגדן ראשוני, נוגדן מונוקלונלי של עכבר נגד 5-methylcytosine, נוגדן שני, כדוריות DynaBeads המשורשרות ל-sheep anti-US IgG, ומעמד מגנטי למבחנות.השלב הראשון בפרוטוקול The meetup הוא הכנת ה-DNA. חיוני להעריך מראש את טיב ה-DNA. נדרש לדעת מהו מצב ה-DNA של הדגימה, והאם הוא בעיקר דו-גדילי או חד-גדילי, שכן כימות מדויק של הדגימה הוא בעל חשיבות עליונה, ושיטות שונות לקביעת כמות ה-DNA עלולות להיפגע מהנוכחות של סוגי DNA לא רצויים.ניתן להעריך בקלות את כמות ה-DNA דו-גדילי באמצעות פוטומטריה ספקטרלית באמצעות NanoDrop 3, 300; טען 1.5 µL והגדר את סוג המדידה ל-nucleic acid, בחר ב-DNA 50 כשיטת החישוב ואתחל את המכשיר עם 1.5 µL של מים. נקה את פדסוטי הניסוי ובצע כיול (blank) למכשיר עם 1.5 µL מהנוזל. הדגימה מומסת ב-נקה את פדסוטי הניסוי, טען 1.5 µL מהדגימה ולחץ על measure.הריכוז יינתן וניתן יהיה להשתמש בו. כדי לחשב את מספר המיקרוליטרים הדרושים עבורי, טבול את A ביחס של 60 עד 80; יחס של 1.8 הוא אידיאלי כאן. דגימה של 1 µg מוכנה.עם זאת, דגימה של 200 nanograms בלבד מספיקה להשגת תוצאות מוצלחות. להמשך, העבירו את דגימת ה-DNA לשפופרת סיליקונית נקייה. הוסיפו מספיק מים סטריליים כדי להגיע לנפח סופי של 50 microliters.יש לבצע סוניקציה של DNA ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation) במבחנות סליקוניזציה כדי למנוע קישור לא ספציפי של DNA וחלבונים לדפנות המבחנה. לאחר הכנת ה-DNA, יש להעביר את הדגימה לסוניקציה; סוניקציה נדרשת כדי לפרק את ה-DNA, שכן שיקוע חיסוני יעיל יותר עם מקטעי DNA קטנים יותר. טענו את הדגימה למכשיר הסוניקציה, ודאו שהגדרת העוצמה מכוונת ל-high (גבוה), ושהמכשיר מכוון ל-30 שניות הפעלה ו-30 שניות השהיה. מלאו את בסיס המכשיר עד לקו המילוי במים בטמפרטורה של 4 °C.בצע סוניקציה לדגימה למשך שבע דקות. עם סיום הסוניקציה, הוצא את המבחנה והנח אותה על קרח. חשוב לבצע אופטימיזציה של תנאי הסוניקציה עבור סוג הדגימה וגודל ה-DNA הצפויים מראש.לדוגמה, דגימת DNA שעברה דגראדציה חלקית תדרוש זמן סוניקציה קצר יותר. ניתן לוודא את תוצרי הסוניקציה באמצעות טכניקות אלקטרופורזה סטנדרטיות. בשלב זה נדרשים מקטעי DNA באורך של 300 עד 1000 base pairs לשימוש מאוחר יותר.בבדיקות מיקרו-מערכים (microarray) ו-PCR, יש לשמור חמישית מה-DNA שישמש כ-DNA קלט או DNA ייחוס; במקרה זה, 800 nanograms של DNA שעבר סוניקציה ישמשו עבור האימונו-השקעה (immunoprecipitation) והיתרה תופרש כ-DNA ייחוס. השלב הבא בפרוטוקול המדיום הוא תגובת האימונו-השקעה או IP; לפני הוספת הנוגדן הראשוני, יש לדנטור את ה-DNA. דנטורציה נדרשת מאחר שהנוגדן הראשוני רגיש ל-DNA גדיל בודד.הנח את הדגימה במקלח מים בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 דקות. עם סיום שלב הדנטורציה, העבר מיד את המבחנה לקרח למשך חמש דקות לפחות. פעולה זו תמנע מה-DNA שעבר דנטורציה להתרנדנ (reanneal) ותאפשר קישור אופטימלי של הנוגדנים לאחר קירור הדגימה.סובב את המבחנה קצרות כדי להוריד את התוכן לתחתית. לאחר מכן, יש להוסיף את הנוגדן הראשוני. יש לבצע טיטרציה לכמות הנוגדן שבה נעשה שימוש עבור כל סדרה ועבור כל יצרן.במקרה זה, אנו מוסיפים 5 µg של נוגדן ראשוני ולאחר מכן מוסיפים תמיסת immunoprecipitation או IP buffer עד לנפח סופי של 500 µL. לאחר מכן, את ה-IP DNA מניחים ברוטטור (rotator) ומדגירים בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים. הסבסוב נדרש כדי למנוע התגבשות של הנוגדנים בתוך המבחנה במהלך הדגירה.כ-15 דקות לפני סיום דגירה של הנוגדן הראשוני, נקה והכן את חרוזי ה-dyna magnetic beads. ראשית, השהה את החרוזים בבקבוקון באופן יסודי באמצעות וורטקס. לאחר מכן, העבר 30 µL של חרוזים לשפופרת סיליקונית נקייה והנח את השפופרת על מעמד מגנטי עבור תגובות מרובות.העבירו 30 µL של חרוזיים לכל תגובה, בתוספת כמות למספר תגובה אחת נוספת כדי לפצות על שגיאות פיפטינג או אובדן מקרי של חלק מהחרוזיים. לדוגמה, עבור שמונה תגובות, הסירו כמות של חרוזיים עבור תשע תגובות, שהם 270 µL.החרוזים המגנטיים יימשכו לעבר דופן הstanch של הrack המגנטי. המתן שתי דקות עד שהחרוזים ינדדו וישקעו למשקע מוגדר על דופן המבחנה. לאחר מכן, הסר והשלך את העל-נוזל (supernatant) באמצעות פיפטה בזהירות, תוך הקפדה לא להפריע לחרוזים על הדופן האחורית עם קצה הפיפטה.החליפו את הנוזל העליון בנפח עודף של IP buffer, ערבבו במערבל (vortex) והחזירו למסגרת המגנטית למשך שתי דקות. חזרו על שטיפה זו פעם נוספת והשביו את חרוזי השטיפה לנפח המקורי של IP buffer. הוציאו את מבחנת הדגימה מהרוטטור עם סיום הדגירה.כדי להשלים את האימונו-פרסיפיטציה (שיקוע חיסוני), הוסיפו 30 µL של חרוזי ניקיון לתגובה והחזירו את המבחנה למערבל סיבובי למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C. במהלך דגירה זו, הנוגדן המשני, שהוא anti mouse IgG, ייקשר לנוגדן העכבר הראשוני. הנוגדים ה-anti mouse מצומדים לחרוזי dyna מגנטיים, המאפשרים שחזור קל של המוצרים הקשורים ואת שלב הטהרה שבא לאחר מכן.לאחר השלמת האינקובציה עם שני הנוגדנים, הנח את מבחנת ה-IP על המגנט למשך שתי דקות. בנקודה זו, ה-DNA הממותיל יהיה קשור לנוגדן הראשוני, שבעצמו יהיה קשור לנוגדן המשני המשורשר ל-dyna bead. הסר והשלך את העל-נוזל (supernatant) והחלף אותו ב-500 µL של IP buffer.ערבבו את תכולת המבחנה והניחו אותה בחזרה על המעמד למשך שתי דקות. חזרו על שטיפה זו עם IP buffer פעם נוספת. לאחר הסרת הנוזל העליון מהשטיפה האחרונה, השביו את החרו지를 למצב של סספנסיות בפעם האחרונה.ב-400 µL של בופר עיכול, טפל בתגובה באמצעות 100 µg של proteinase K והדגר למשך לילה ב-50 °C. הטיפול ב-proteinase K נחוץ כדי לעכל את חלבוני הנוגדנים וכל חלבון שיורי הקשור ל-DNA, ובכך לאפשר לשחרור ה-DNA המתילטורי אל התמיסה. טיהור ה-DNA מבוצע ביום השני של פרוצדורת המפגש; הוצא את מבחנת העיכול מהמדגרה.בתוך מ 빠르게 fume hood, הוסיפו למבחנה 500 µL של pheno chloroform ביחס של 1:1 ב-pH 7 וערבלו היטב במכשיר vortex. סבבו את המבחנה במשך 10 דקות ב-13,000 G. הסירו בזהירות את השכבה המימית העליונה מהמבחנה, מבלי להפריע לממשק או להסיר חלק מהשכבה האורגנית. העבירו את השכבה המימית למבחנה חדשה.ניתן לבצע סבב חילוץ שני אם הממשק נראה עכור. לאחר מכן, הוסיפו נפח השווה למעשר מהנפח של sodium acetate בריכוז 3M, שבמקרה זה הוא 40 µL. ניתן להשתמש ב-1 µL של גליקוגן כנשא כדי להקל על ניקוי המשקע.ערבב את תוכן המבחנה באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסף נפח כפול של 100% ethanol, ערבב בוורטקס והקפא במקפיא בטמפרטורה של 20°C- למשך 20 דקות. לאחר ההקפאה, השקע את ה-DNA המשקע בcentrifuge ב-13,000 G ובטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות.משקע DNA ייווצר בתחתית המבחנה. הוציאו את המבחנה מהצנטריפוגה והסירו את האתנול. היזהרו לא להפריע למשקע בתחתית המבחנה.ייתכן שיהיה צורך בסבב סרבוב קצר (pulse spin) כדי להסיר שאריות אתנול. כדי לשטוף את המשקע, יש להוסיף 500 µL של אתנול 70% קר, לבצע ערבוב במערבל Vortex, ולסרבב שוב למשך 20 דקות ב-13,000 G ובטמפרטורה של 4 °C. עם סיום הסבב השני, יש לבצע סבב סרבוב קצר להסרת אתנול 70% ולהסיר את שאריות האתנול באמצעות פיפטה.השאירו את המבחנה על מעמד כאשר הפקק פתוח כדי לייבש את המשקע ולאפשר לאתנול שנותר להתאדות. לבסוף, השביו את המשקע המכיל DNA מועשר במתילציה בלבד ב-10 µL של מים סטריליים, והמתינו זמן מספיק עד להמסה מלאה של משקע ה-DNA לפני השימוש. מומלץ לאמת את יעילות התהליך באמצעות PCR.ניתן לבצע זאת על ידי הרצת תגובות PCR שנועדו להגביר תוצרים הממחישים באופן דיפרנציאלי מקטעי DNA מתילתיים ובלתי מתילתיים עבור פריימרים המגבירים DNA אנושי נורמלי. ניתן להשתמש באזור הבקרה של ההטבעה (imprinting control region) של H 19 בשילוב עם פריימרים שנועדו להגביר אזור בגנום שאינו מתילתי. דוגמאות לרצפי פריימרים ותנאי מחזוריות PCR ניתן למצוא בפרוטוקול המצורף.בשלב זה, יש לשלוף את ה-DNA של הקלט או את ה-DNA של הייחוס שהופרשו בתחילת פרוטוקול ה-meetup. סדרה אחת של תגובות PCR תוכנה באמצעות ה-DNA של הקלט, והסדרה השנייה תוכנה באמצעות ה-DNA של ה-IP המועשר במתילציה. אם ה-meetup הצליח, ה-IP PCR ייצב תוצר באמצעות הפריימרים למתילציה, ולא ייצב תוצר באמצעות הפריימרים של הבקרה.לעומת זאת, ה-PCR של הקלט צריך להפיק תוצרים באמצעות שני הפריימרים, שכן הוא מכיל מקטעי DNA מתילתיים ולא מתילתיים כאחד. DNA המועשר במקטעים מתילתיים יכול לשמש למספר יישומים המשכיים, כגון ריצוף PCR ואנליזת מיקרו-מערך (microarray).בעת שילוב עם טכניקות אחרות של ביולוגיה מולקולרית, ניתן להשתמש בו לבדיקת מצב המתילציה של DNA באופן ספציפי לאתר או בפריסה גנומית רחבה, לצורך פרופיל מתילציה או חקר האפיגנומיקה.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

סרטון זה מתאר את הטכניקה של כתם נקודה כדי לקבוע את רמת המתילציה של DNA בכונדרוציטים אנושיים במבחנה באמצעות כתם של דגימות DNA על קרום ניילון וההדמיה שלאחר מכן באמצעות נוגדנים חד שבטיים. זה עוזר לקבוע את הפנוטיפ של כונדרוציטים בשלבים שונים בתרבית.

5-מתילציטוזין נקודה כתם כדי לקבוע את מידת מתילציה DNA

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

למד את פרוטוקול MeDIP לבידוד DNA מתילצ'ן בצורה לא מוטה. השיטה משתמשת בנוגדנים ספציפיים ל-5-methylcytosine ומאפשרת חקר סימנים אפיגנטיים בפיתוח ובמחלות.

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

גלה סרטונים נוספים