Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי
26 בנובמבר 2008
שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.
שמי מריה ואני עובדת ב-Y Healthcare ב-NOS בשוודיה. חלבונים על פני התא מעורבים לעתים קרובות בתקשורת בין תאים לסביבתם ולכן הם בעלי עניין מיוחד במחקר, במטרה להשיג תובנות נוספות על מחלות כמו גם וריאציות ביולוגיות אחרות הנגרמות על ידי שינויים בסביבת התא. בסרטון זה אני הולך להראות לכם פרוטוקול תיוג פשוט של פני התא ותוכלו להעשיר חזותית את החלבונים הנמוכים הללו ללא שיפור פיזי ולחקור את ההבדלים בין חלבוני פני התא הללו באמצעות הטכנולוגיה.
אם אתה מוצא את הטכנולוגיה הזו מעניינת, תוכל למצוא מידע נוסף במדריך הדו-ממדי. יתר על כן, יש לנו הערת יישום בנושא הספציפי הזה שתוכל להוריד מהעבודה בפרוטוקול תיוג משטח התא הנראה למעלה, אתה מתייג את התאים כשהם עדיין שלמים. במהלך תהליך התיוג, לצבע תהיה גישה רק לחלבוני פני התא.
לאחר שלב התיוג, התאים מנותחים כדי לאמת תיוג ספציפי למשטח התא. דגימת התווית חולקה לחלבוני ממברנה וציטוזוליים. דגימה לא מקוטעת הוכנה במקביל.
לשם השוואה, ניתוח פיצול זה אינו הכרחי, אלא נעשה כאן רק כדי להראות שפרוטוקול פני התא הוא ספציפי לקצות פרו פני התא. ביצענו גם את פרוטוקול התיוג הסטנדרטי של ETH שאינו דיאטה שנראה מתחת לתאים שקרים לפני התיוג, ובדרך זו כל החלבונים התאיים נגישים לתיוג. לאחר שלב התיוג, הדגימות עוברות אלקטרופורזה דו-ממדית.
תאים דבקים מנותקים באמצעות הליך לא אנזימטי כדי למנוע עיכול של חלבוני פני התא הממוקדים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בשוטר הגומי, אך שימוש באמצעי דיסוציאציה של אנזים שלושה תאים הוא גם ספירת אפשרויות ומחלקים את תרחיפי התאים ל-quas של חמישה עד 10 מיליון תאים לכל צינור. לאחר מכן התאים נשטפים ונשטפים ב-H-P-S-S-P-H 7.4 כדי להסיר עקבות של תרבית תאים.
זיהום מדיה מחלבוני סרום ורכיבים פלואורסצנטיים יכול להפריע לתיוג ולזיהוי. תאים הגדלים בתרחיף עוברים כדורים ונשטפים ישירות לפני שלב התיוג לאחר הכביסה. לוח התאים מושעה מחדש במאגר תיוג קר קרח של 200 מיקרוליטר המכיל HPSS pH 8.5 ואוריה טוחנת אחת.
לתנאי תיוג אופטימליים של חלבוני פני התא בדוק תמיד את ה-pH. לפני התיוג, השתמשנו ב-600 תמונות תבנית צד עבור 10 מיליון תאי CHO. היחס האופטימלי בין עין הצד למספר התאים ישתנה בהתאם לסוג התא.
מכיוון שאיננו יודעים את ריכוזי החלבון המדויקים על פני התא. כיצד לקבוע את התנאים האופטימליים לתיוג צד של חלבונים מתואר במדריך לעקרונות ושיטות אלקטרופורזה דו-ממדית. התאים מודגרים עם רצפת עין צד D, קוביות מינימליות למשך 20 דקות על קרח בחושך.
לאחר תגובת התיוג, מרווה את הצבע הלא מגיב על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של ליזין 10 מילי-מולרי. תאי התווית נשטפים כעת פעמיים במאגר HPSS pH 7.4 קר כדי להסיר את העין הצדדית העודפת. לכן לא יישאר צבע חופשי לתיוג תוך-תאי או חלבונים לא רצויים בשלב הבא, שהוא ליזיס תאים.
החלבונים על פני התא מסומנים כעת והתאים נשטפים ומוכנים לרישיון. הכדור משלב הכביסה האבוד מושעה מחדש במאגר ליזה קר של 150 מיקרוליטר המכיל שבע אוריה טוחנת, שתי אוריה טוחנת, 4% עצים 30 מילי-מולארי מגנזיום אצטט pH 8.5 ומשאיר על הקרח לפחות שעה אחת עם מיסוי מערבולת מדי פעם. הדגימות מוכנות כעת להפרדה דו-ממדית.
הצעד הראשון באלקטרוליזה הוא הכנת רצועות IPD להחזרת נוזלים. הכן תמיסת התייבשות מחוזית על ידי הוספת מאגר IPG המתאים למרווח ה-pH של הרצועות המשמשות, והוסף את התמיסה בעדשת מגש ההתייבשות. הסר את סרט המגן של רצועת ה-IPG והנח את הרצועות בזהירות עם ג'ל מיובש עם הפנים כלפי מטה במגש ההתייבשות המכיל את תמיסת ההתייבשות.
סוגרים את המכסה של קופסת ה-IPG ומרטיבים את הרצועות למשך הלילה. בממד הראשון, מיקוד איזואלקטרי, החלבונים מופרדים על פי ה-pi שלהם. זה מבוצע באמצעות ה-IPG ארבע שלוש.
הרצועות המיובשות מונחות בסעפת והאלקטרודה מותקנת מעל. 50 מיקרוגרם מכל דגימה יושמו באמצעות מכסי יישום מדגם. יישמנו ישירות דגימות לא מקוטעות ללא פיצול מוקדם או חילקנו את הדגימות לשברים ממברניים וציטוזוליים לפני החלתן.
העופרת סגורה כדי להגן על דגימות הפלואורסצנט מפני אור. המכשיר תוכנן על פי המלצה ופעל בן לילה. ג'לים גדולים של 12% למבי עלו באמצעות ג'ל 12 למבוגרים.
נוספה תמיסת עקירה של קוסטר כדי למנוע ג'ל אקרי מפולימר בצינורות. הג'לים הורשו להתפלמר למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר המיקוד האיזואלקטרי, הרצועות מוסרות ומתאזנות במאגר המכיל SDS בשני שלבים באמצעות DTT כדי להפחית את קשרי הדי סולפיד של שאריות ציסטאין ואחריו אלקילציה עם האצטמיד שלך כדי למנוע שינוי על ידי אקרילאמיד.
רצועות ה-IPG טובלות במאגר רץ ומונחות בזהירות על גבי שני ג'לי החפירה הגדולים. הימנע מלכידת אוויר בין הרצועות והג'ל האטום על ידי הוספת תמיסת אגרו מומסת של 2% עם ברומו אנול כחול מעל. הג'לים מוכנים כעת להפרדת דפי SDS של הממד השני בדף SDS של הממד השני.
החלבונים יופרדו לפי משקל מולקולרי וזה מבוצע במערכת שש טונאלית. מלאו את תא האלקטרופורזה במאגר ריצה אנודי, הכניסו את הג'לים ומלאו את התא העליון בתוכנית חיץ ריצה קתודית. ספק הכוח על פי ההמלצות והפעל את הממד השני מוגן מאור למשך כארבע עד חמש שעות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
לאחר האלקטרופורזה של הממד השני, קלטות הג'ל מונחות באמצעות התפסנים בהדמיית הפלואורסצנט של הטייפון. ניתן לסרוק שני ג'לים ושלושה ערוצים בו זמנית. התוצאה משני DL אלה מראה רזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה בדגימה, גם אם ישנן כמה מגבלות ידועות על חלבונים הידרופוביים שיש לזהות ב-A two DL.התוצאות מראות הרבה נקודות תווית חדשות על פני התא המוצגות כאן באדום שאינן מזוהות באמצעות פרוטוקול התיוג הסטנדרטי המוצג כאן בירוק.
תוצאות אלה מראות כי פרוטוקול תיוג פני התא הוא ספציפי ביותר לתיוג חלבוני פני התא. מכיוון שחלבוני פני התא מסומנים באופן בלעדי, קל יותר לדמיין אותם ונמנעת הנחתה על ידי חלבונים ציטוזוליים בשפע. התמונה הפלואורסצנטית של ג'לים עם שבר ממברנה לא מקוטע או שבר ציטוזולי מוצגת למעלה.
להלן תמונה של אותו כתם פוסט ג'ל עם כסף. התוצאות אינן מראות תיוג פלואורסצנטי של חלבונים ציטוזוליים, אך צביעת הכסף מראה שיש חלבונים בג'לים. התוצאות מראות גם דפוסי מפות נקודתיות דומות משברים לא מקוטעים וממברנה המדגימים כי אין צורך בפיצול לפני אלקטרופורזה דו-ממדית, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לפשוט ונוח כאחד.
SI שתיים, ת"י שלוש ו-SCI חמש מציגים דפוסי תיוג דומים וכולם תואמים לפרוטוקול פני השטח של התאים. ניסוי דיאטה בוצע תוך שימוש בכל שלושת העין הצדדית של רצפת DI מינימלית לחקר ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני פני התא בתאי CHO של רעב בסרום לפרקי זמן שונים. CY שתי דגימות משטח תאים מכל הדגימות בניסוי אוגדו ושימשו כסטנדרט פנימי.
ניתן לעקוב אחר השינויים הדיפרנציאליים של מספר חלבונים על פני התא במהלך תקופת הרעב. למעלה מ-18 חלבוני ממברנה חדשים זוהו באמצעות פרוטוקול פני התא שלא זוהו בפרוטוקול הסטנדרטי למציאת זהות החלבונים בג'ל ההכנה. היה צורך לעלות עם דגימת פני התא כדי להקל על ההתאמה בחזרה לכתמים במערך הנתונים האנליטי.
יש תוצאות. התוצאות מראות רזולוציה גבוהה של מספר רב של חלבונים על פני התא. פרוטוקול זה ספציפי מאוד לחלבוני פני התא ולא נראה תיוג של חלבונים תוך-תאיים.
בשיטה זו, אתה יכול לזהות יותר חלבון על פני התא בהשוואה לפרוטוקול סטנדרטי, וכפי שכבר ראית, זה פרוטוקול פשוט מאוד להפעלה. אתה פשוט מסמן את חלבוני פני התא שלך כשהם עדיין שלמים ומפעיל אותם ישירות על אלקטרופורזה דו-ממדית ללא פיצול ממברנה. אז זה פרוטוקול טוב מאוד לחקר חלבוני פני התא וההבדלים בין אלה עם טכנולוגיית D.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה פשוטה לסימון פלואורסצנטי של חלבוני פני השטח של תאים, המשפרת את זיהוים ללא צורך בפרקציונציה. המחקר עושה שימוש באלקטרופורזה דו-ממדית ובטכנולוגיית Ettan™ DIGE כדי לנתח שפע דיפרנציאלי בחלבונים אלו.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ניתוח חלבונים
- טכניקות סימון פלואורסצנטי
רקע
- חלבונים על פני השטח של התא ממלאים תפקיד מכריע בתקשורת תאית.
- הבנת חלבונים אלו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות שונות.
- חלבונים בעלי שכיחות נמוכה הם לרוב מאתגרים למחקר בשל נוכחותם המעטה.
- מחקר זה נועד לשפר את הגילוי והניתוח של חלבונים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול סימון המעשיר חלבונים בעלי שכיחות נמוכה על פני השטח של התא.
- סיוע בחקר ההבדלים בין חלבונים על פני השטח של התא.
- אספקת שיטה שאינה דורשת העשרה פיזית של הדגימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון פלואורסצנטי של תאים שלמים.
- אלקטרופורזה דו-ממדית להפרדת חלבונים.
- טכנולוגיית ™Ettan DIGE לזיהוי משופר.
- ניתוח של שפע דיפרנציאלי בחלבונים על פני השטח של התא.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של חלבוני פני השטח של התא ללא פרקציונציה.
- זיהוי משופר של חלבונים בריכוז נמוך.
- הדגמה של הבדלים בשפע החלבונים באמצעות השיטה שפותחה.
- אספקת פרוטוקול מהימן ליישומי מחקר עתידיים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של חלבוני פני השטח של התא.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר בתקשורת תאית ובמנגנוני מחלות.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על פרוטוקול זה להשגת תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימון סלקטיבי של חלבונים על פני השטח של התא באמצעות צבעי CyDye DIGE Fluor מינימליים מאפשר זיהוי ברגישות גבוהה של חלבוני ממברנה בריכוז נמוך, שהם קריטיים לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקול זה תומך בניתוח כמותי ומרובה (multiplexed) של שינויים בביטוי חלבונים, המספק מידע ישיר לביסוס רמת הוודאות החיזויית בנקודות מפתח בשרשרת הפיתוח הביו-פארמצבטית. גישה זו מייעלת את זרימת העבודה על ידי ביטול הצורך בפרקציונציה, ובכך משפרת את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) עבור מחקר ופיתוח ארגוני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של דינמיקת חלבונים על פני השטח של התא, הרלוונטית למחלה ולתגובה לתרופות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד שינויים בחלבוני ממברנה תחת תנאים מוגדרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין שינויים בחלבונים על פני השטח לבין שינויים בחלבונים תוך-תאיים.
- משפר את הביטחון הניבוי עבור קידום מטרות בשלב הגילוי (discovery pipeline).
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות תאים עובדות ומסומנות באופן ספציפי עבור תהליכי סינון בהמשך הדרך.
- מספק פלטים כמותיים ומולטיפלקס באמצעות 2-D DIGE ותוכנת ניתוח DeCyder.
- מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה על ידי מזעור השונות בהכנת הדגימות.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות על ידי התמקדות במטרות נגישות לפני השטח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מעקב אחר שינויים בחלבוני פני השטח של התא במהלך הפרעות סביבתיות או טיפוליות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לזיהוי סממנים ביולוגיים (biomarkers) חסונים.
- מפחית סיכונים תרגומיים באמצעות תמיכה בניתוח כמותי ומאובסס סטטיסטית של ביטוי חלבונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול סימון זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification), ותומך הן בתיקוף מטרות מבוסס-השערות והן במוכנות לסריקה כמותית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע למעורבות של חלבונים על פני השטח של התא באיתות ובהסתגלות.
- סריקה: מספקת תוצרי בדיקה רב-ערוציים (multiplexed) הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות בעלות תמיכה סטטיסטית עבור ביטוי חלבונים דיפרנציאלי.
- מחקר תרגומי: מסייע להלימה של סממנים ביולוגיים על ידי מעקב אחר שינויים בחלבוני פני השטח תחת תנאים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה, הניתן להתאמה לסוגים שונים של תאים ולתכנונים ניסיוניים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה על ידי ביטול הפרקציה ומאפשר ניתוח רב-ערוצי (multiplexed).
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) וביעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על פורטפוליו: משפר את תיעוד העדיפויות המותאם לסיכון ואת קידומה של נכסים בשלב הגילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של סימון פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית (2-D electrophoresis).
- דורש גישה לפלטפורמות הדמיה וניתוח תואמות, כגון תוכנות Ettan DIGE ו-DeCyder.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי סימון וניתוח בין צוותים שונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים באמצעות אופטימיזציה של יחסי הצבע-לתא ותנאי הסימון.
- מוגבל על ידי גילוי של חלבונים הידרופוביים מאוד או חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה מאוד, כפי שצוין בנתוני המקור.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Introduction to Cell Surface Protein Labeling with Ettan DIGE System
1:12
Overview of the Experiment
2:19
Sample Preparation
3:13
Labeling with CyDye DIGE Fluors
4:03
Incubation and Quenching
4:45
Cell Lysis
6:31
First Dimension ISO-Electric Focusing
5:29
Rehydration of IPG Strips
7:27
Gel Casting
9:43
Second Dimension SDS-Page
7:55
Equilibration of IPG Strips
10:29
Gel Scanning
10:52
Results of Cell Surface Protein Labeling
11:21
Comparison with Fractionated Runs
12:30
2D DIGE Analysis
13:27
Conclusions
