Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי
November 26th, 2008
שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.
שמי מריה ואני עובדת ב-Y Healthcare ב-NOS בשוודיה. חלבונים על פני התא מעורבים לעתים קרובות בתקשורת בין תאים לסביבתם ולכן הם בעלי עניין מיוחד במחקר, במטרה להשיג תובנות נוספות על מחלות כמו גם וריאציות ביולוגיות אחרות הנגרמות על ידי שינויים בסביבת התא. בסרטון זה אני הולך להראות לכם פרוטוקול תיוג פשוט של פני התא ותוכלו להעשיר חזותית את החלבונים הנמוכים הללו ללא שיפור פיזי ולחקור את ההבדלים בין חלבוני פני התא הללו באמצעות הטכנולוגיה.
אם אתה מוצא את הטכנולוגיה הזו מעניינת, תוכל למצוא מידע נוסף במדריך הדו-ממדי. יתר על כן, יש לנו הערת יישום בנושא הספציפי הזה שתוכל להוריד מהעבודה בפרוטוקול תיוג משטח התא הנראה למעלה, אתה מתייג את התאים כשהם עדיין שלמים. במהלך תהליך התיוג, לצבע תהיה גישה רק לחלבוני פני התא.
לאחר שלב התיוג, התאים מנותחים כדי לאמת תיוג ספציפי למשטח התא. דגימת התווית חולקה לחלבוני ממברנה וציטוזוליים. דגימה לא מקוטעת הוכנה במקביל.
לשם השוואה, ניתוח פיצול זה אינו הכרחי, אלא נעשה כאן רק כדי להראות שפרוטוקול פני התא הוא ספציפי לקצות פרו פני התא. ביצענו גם את פרוטוקול התיוג הסטנדרטי של ETH שאינו דיאטה שנראה מתחת לתאים שקרים לפני התיוג, ובדרך זו כל החלבונים התאיים נגישים לתיוג. לאחר שלב התיוג, הדגימות עוברות אלקטרופורזה דו-ממדית.
תאים דבקים מנותקים באמצעות הליך לא אנזימטי כדי למנוע עיכול של חלבוני פני התא הממוקדים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בשוטר הגומי, אך שימוש באמצעי דיסוציאציה של אנזים שלושה תאים הוא גם ספירת אפשרויות ומחלקים את תרחיפי התאים ל-quas של חמישה עד 10 מיליון תאים לכל צינור. לאחר מכן התאים נשטפים ונשטפים ב-H-P-S-S-P-H 7.4 כדי להסיר עקבות של תרבית תאים.
זיהום מדיה מחלבוני סרום ורכיבים פלואורסצנטיים יכול להפריע לתיוג ולזיהוי. תאים הגדלים בתרחיף עוברים כדורים ונשטפים ישירות לפני שלב התיוג לאחר הכביסה. לוח התאים מושעה מחדש במאגר תיוג קר קרח של 200 מיקרוליטר המכיל HPSS pH 8.5 ואוריה טוחנת אחת.
לתנאי תיוג אופטימליים של חלבוני פני התא בדוק תמיד את ה-pH. לפני התיוג, השתמשנו ב-600 תמונות תבנית צד עבור 10 מיליון תאי CHO. היחס האופטימלי בין עין הצד למספר התאים ישתנה בהתאם לסוג התא.
מכיוון שאיננו יודעים את ריכוזי החלבון המדויקים על פני התא. כיצד לקבוע את התנאים האופטימליים לתיוג צד של חלבונים מתואר במדריך לעקרונות ושיטות אלקטרופורזה דו-ממדית. התאים מודגרים עם רצפת עין צד D, קוביות מינימליות למשך 20 דקות על קרח בחושך.
לאחר תגובת התיוג, מרווה את הצבע הלא מגיב על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של ליזין 10 מילי-מולרי. תאי התווית נשטפים כעת פעמיים במאגר HPSS pH 7.4 קר כדי להסיר את העין הצדדית העודפת. לכן לא יישאר צבע חופשי לתיוג תוך-תאי או חלבונים לא רצויים בשלב הבא, שהוא ליזיס תאים.
החלבונים על פני התא מסומנים כעת והתאים נשטפים ומוכנים לרישיון. הכדור משלב הכביסה האבוד מושעה מחדש במאגר ליזה קר של 150 מיקרוליטר המכיל שבע אוריה טוחנת, שתי אוריה טוחנת, 4% עצים 30 מילי-מולארי מגנזיום אצטט pH 8.5 ומשאיר על הקרח לפחות שעה אחת עם מיסוי מערבולת מדי פעם. הדגימות מוכנות כעת להפרדה דו-ממדית.
הצעד הראשון באלקטרוליזה הוא הכנת רצועות IPD להחזרת נוזלים. הכן תמיסת התייבשות מחוזית על ידי הוספת מאגר IPG המתאים למרווח ה-pH של הרצועות המשמשות, והוסף את התמיסה בעדשת מגש ההתייבשות. הסר את סרט המגן של רצועת ה-IPG והנח את הרצועות בזהירות עם ג'ל מיובש עם הפנים כלפי מטה במגש ההתייבשות המכיל את תמיסת ההתייבשות.
סוגרים את המכסה של קופסת ה-IPG ומרטיבים את הרצועות למשך הלילה. בממד הראשון, מיקוד איזואלקטרי, החלבונים מופרדים על פי ה-pi שלהם. זה מבוצע באמצעות ה-IPG ארבע שלוש.
הרצועות המיובשות מונחות בסעפת והאלקטרודה מותקנת מעל. 50 מיקרוגרם מכל דגימה יושמו באמצעות מכסי יישום מדגם. יישמנו ישירות דגימות לא מקוטעות ללא פיצול מוקדם או חילקנו את הדגימות לשברים ממברניים וציטוזוליים לפני החלתן.
העופרת סגורה כדי להגן על דגימות הפלואורסצנט מפני אור. המכשיר תוכנן על פי המלצה ופעל בן לילה. ג'לים גדולים של 12% למבי עלו באמצעות ג'ל 12 למבוגרים.
נוספה תמיסת עקירה של קוסטר כדי למנוע ג'ל אקרי מפולימר בצינורות. הג'לים הורשו להתפלמר למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר המיקוד האיזואלקטרי, הרצועות מוסרות ומתאזנות במאגר המכיל SDS בשני שלבים באמצעות DTT כדי להפחית את קשרי הדי סולפיד של שאריות ציסטאין ואחריו אלקילציה עם האצטמיד שלך כדי למנוע שינוי על ידי אקרילאמיד.
רצועות ה-IPG טובלות במאגר רץ ומונחות בזהירות על גבי שני ג'לי החפירה הגדולים. הימנע מלכידת אוויר בין הרצועות והג'ל האטום על ידי הוספת תמיסת אגרו מומסת של 2% עם ברומו אנול כחול מעל. הג'לים מוכנים כעת להפרדת דפי SDS של הממד השני בדף SDS של הממד השני.
החלבונים יופרדו לפי משקל מולקולרי וזה מבוצע במערכת שש טונאלית. מלאו את תא האלקטרופורזה במאגר ריצה אנודי, הכניסו את הג'לים ומלאו את התא העליון בתוכנית חיץ ריצה קתודית. ספק הכוח על פי ההמלצות והפעל את הממד השני מוגן מאור למשך כארבע עד חמש שעות או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
לאחר האלקטרופורזה של הממד השני, קלטות הג'ל מונחות באמצעות התפסנים בהדמיית הפלואורסצנט של הטייפון. ניתן לסרוק שני ג'לים ושלושה ערוצים בו זמנית. התוצאה משני DL אלה מראה רזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה בדגימה, גם אם ישנן כמה מגבלות ידועות על חלבונים הידרופוביים שיש לזהות ב-A two DL.התוצאות מראות הרבה נקודות תווית חדשות על פני התא המוצגות כאן באדום שאינן מזוהות באמצעות פרוטוקול התיוג הסטנדרטי המוצג כאן בירוק.
תוצאות אלה מראות כי פרוטוקול תיוג פני התא הוא ספציפי ביותר לתיוג חלבוני פני התא. מכיוון שחלבוני פני התא מסומנים באופן בלעדי, קל יותר לדמיין אותם ונמנעת הנחתה על ידי חלבונים ציטוזוליים בשפע. התמונה הפלואורסצנטית של ג'לים עם שבר ממברנה לא מקוטע או שבר ציטוזולי מוצגת למעלה.
להלן תמונה של אותו כתם פוסט ג'ל עם כסף. התוצאות אינן מראות תיוג פלואורסצנטי של חלבונים ציטוזוליים, אך צביעת הכסף מראה שיש חלבונים בג'לים. התוצאות מראות גם דפוסי מפות נקודתיות דומות משברים לא מקוטעים וממברנה המדגימים כי אין צורך בפיצול לפני אלקטרופורזה דו-ממדית, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לפשוט ונוח כאחד.
SI שתיים, ת"י שלוש ו-SCI חמש מציגים דפוסי תיוג דומים וכולם תואמים לפרוטוקול פני השטח של התאים. ניסוי דיאטה בוצע תוך שימוש בכל שלושת העין הצדדית של רצפת DI מינימלית לחקר ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני פני התא בתאי CHO של רעב בסרום לפרקי זמן שונים. CY שתי דגימות משטח תאים מכל הדגימות בניסוי אוגדו ושימשו כסטנדרט פנימי.
ניתן לעקוב אחר השינויים הדיפרנציאליים של מספר חלבונים על פני התא במהלך תקופת הרעב. למעלה מ-18 חלבוני ממברנה חדשים זוהו באמצעות פרוטוקול פני התא שלא זוהו בפרוטוקול הסטנדרטי למציאת זהות החלבונים בג'ל ההכנה. היה צורך לעלות עם דגימת פני התא כדי להקל על ההתאמה בחזרה לכתמים במערך הנתונים האנליטי.
יש תוצאות. התוצאות מראות רזולוציה גבוהה של מספר רב של חלבונים על פני התא. פרוטוקול זה ספציפי מאוד לחלבוני פני התא ולא נראה תיוג של חלבונים תוך-תאיים.
בשיטה זו, אתה יכול לזהות יותר חלבון על פני התא בהשוואה לפרוטוקול סטנדרטי, וכפי שכבר ראית, זה פרוטוקול פשוט מאוד להפעלה. אתה פשוט מסמן את חלבוני פני התא שלך כשהם עדיין שלמים ומפעיל אותם ישירות על אלקטרופורזה דו-ממדית ללא פיצול ממברנה. אז זה פרוטוקול טוב מאוד לחקר חלבוני פני התא וההבדלים בין אלה עם טכנולוגיית D.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שיטה פשוטה לסימון פלואורסצנטי של חלבונים על פני תאים, ומגביר את זיהויים ללא פרקציונציה. המחקר משתמש באלקטרופורזה דו-ממדית וטכנולוגיית Ettan™ DIGE כדי לנתח שפע דיפרנציאלי בחלבונים אלו.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- ניתוח חלבונים
- טכניקות סימון פלואורסצנטי
רקע
- חלבונים על פני התא משחקים תפקיד מכריע בתקשורת תאית.
- הבנת חלבונים אלו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות שונות.
- חלבונים בעלי שפע נמוך מאתגרים לעיתים קרובות למחקר בגלל נוכחותם העדינה.
- מחקר זה נועד לשפר את זיהוי וניתוח של חלבונים כאלה.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול סימון שמעשיר חלבוני פני תא בעלי שפע נמוך.
- להקל על המחקר של הבדלים בחלבוני פני תא.
- לספק שיטה שאינה דורשת שיפור פיזי של הדגימות.
שיטות ששימשו
- סימון פלואורסצנטי של תאים שלמים.
- אלקטרופורזה דו-ממדית להפרדת חלבונים.
- טכנולוגיית Ettan™ DIGE לזיהוי משופר.
- ניתוח שפע דיפרנציאלי בחלבוני פני תא.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של חלבוני פני תא ללא פרקציונציה.
- זיהוי משופר של חלבונים בעלי שפע נמוך.
- הוכחת הבדלים בשפע החלבונים באמצעות השיטה שפותחה.
- מתן פרוטוקול אמין ליישומים מחקריים עתידיים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של חלבוני פני תא.
- היא פותחת דרכים חדשות למחקר בתקשורת תאית ומנגנוני מחלות.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על פרוטוקול זה לתובנות נוספות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes enables high-specificity detection of low-abundance membrane proteins critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This protocol supports multiplexed, quantitative analysis of protein expression changes, directly informing predictive confidence at key inflection points in the biopharma pipeline. The approach streamlines workflows by eliminating the need for fractionation, enhancing reproducibility and scalability for enterprise R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell-surface protein dynamics relevant to disease and drug response.
- Supports functional target validation by isolating membrane protein changes under defined conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing surface from intracellular protein alterations.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, specifically labeled cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, multiplexed outputs using 2-D DIGE and DeCyder analysis software.
- Enables assay standardization and reproducibility by minimizing sample preparation variability.
- Supports reliable compound evaluation by focusing on surface-accessible targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by tracking cell-surface protein changes during environmental or treatment perturbations.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust biomarker detection.
- Reduces translational risk by supporting quantitative, statistically validated protein expression analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and quantitative screening readiness.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cell-surface protein involvement in signaling and adaptation.
- Screening: Provides reproducible, multiplexed assay outputs for comparative analysis.
- Analytics: Delivers quantitative, statistically supported measurements for differential protein expression.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by tracking surface protein changes under disease-relevant conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating fractionation and enabling multiplexed analysis.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling and 2-D electrophoresis techniques.
- Needs access to compatible imaging and analysis platforms such as Ettan DIGE and DeCyder software.
- Demands cross-team standardization of labeling and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types with optimization of dye-to-cell ratios and labeling conditions.
- Limited by detection of highly hydrophobic or very high molecular weight proteins, as noted in source data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Introduction to Cell Surface Protein Labeling with Ettan DIGE System
1:12
Overview of the Experiment
2:19
Sample Preparation
3:13
Labeling with CyDye DIGE Fluors
4:03
Incubation and Quenching
4:45
Cell Lysis
6:31
First Dimension ISO-Electric Focusing
5:29
Rehydration of IPG Strips
7:27
Gel Casting
9:43
Second Dimension SDS-Page
7:55
Equilibration of IPG Strips
10:29
Gel Scanning
10:52
Results of Cell Surface Protein Labeling
11:21
Comparison with Fractionated Runs
12:30
2D DIGE Analysis
13:27
Conclusions
