Divisione cellulare

1. Osservare il Ciclo Cellulare in una Punta di Radice Expand
   • Ipotesi: L'ipotesi sperimentale è che nelle fette di punta delle radici che sono state trattate con nocodazolo, una sostanza chimica che interferisce con la polimerizzazione microtubulare, tutte le cellule verranno arrestate nella stessa fase del ciclo cellulare e che nelle fette di punta di cipolla non trattate verranno visualizzate tutte le diverse fasi del ciclo cellulare. L'ipotesi nulla è che non ci saranno differenze nella mitosi tra i due gruppi e che verranno visualizzate diverse fasi del ciclo cellulare.
   • Per prepararti a questo esperimento utilizzerai una cipolla che è stata messa in acqua per diversi giorni fino a quando non avranno iniziato a germogliare nuove punte di radici bianche. Usa una lama di rasoio per tagliare un pezzo di 1 cm dall'estremità di una delle punte della radice.
   • Metti la fetta di cipolla in una provetta da microcentrifuga etichettata "N" per la condizione di nocodazolo.
   • Quindi, taglia un secondo pezzo di punta di radice di cipolla di 1 cm e mettilo in una provetta da microcentrifuga etichettata "C" per la condizione di controllo.
   • Aggiungi 2 μL di 5 mg/mL di nocodazolo a 1 mL di acqua nella provetta per microcentrifuga etichettata N e 1 mL di acqua solo alla provetta etichettata C.
   • Lascia incubare le provette contenenti le punte delle radici per 12 ore e pulisci l'area di lavoro con etanolo al 70%.
   • Quando l'incubazione è completa, imposta un blocco termico a 60 ºC.
   • Lavare le punte trattate con nocodazolo con acqua e poi aspirare il liquido.
   • Ripeti questo lavaggio altre due volte, per un totale di tre lavaggi.
   • Riempi entrambe le provette con 1 mL di un normale acido cloridrico. Incubare le provette in un blocco termico a 60 ºC per 12 - 15 minuti, quindi gettare l'acido in un pallone di scarto.
   • Ora, aggiungi 1 mL di acqua distillata goccia a goccia nelle provette almeno tre volte per risciacquare i campioni.
   • Ora aggiungi un microlitro di colorante DAPI a 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   • Quindi metti 50 μL di questo colorante DAPI diluito in ogni provetta e lasciali a temperatura ambiente per incubare per 12 minuti.
   • Dopodiché, eseguire tre lavaggi con acqua distillata come nel passaggio 10.
   • Etichetta un vetrino per microscopio come 'Controllo' e un altro come 'Nocodazolo'.
   • Trasferisci le radici colorate sui rispettivi vetrini da microscopio e aggiungi una goccia d'acqua al vetrino di controllo e una goccia di nocodazolo al vetrino di nocodazolo.
   • Usa la lama del rasoio per rimuovere le parti non macchiate di ogni punta della radice e posiziona un vetrino copritutto su ogni campione.
   • Premi con cautela su ogni vetrino coprioggetto con la punta del dito guantato, quindi lascia riposare i vetrini per 10 minuti.
   • Infine, visualizza i vetrini sotto l'obiettivo 40X di un microscopio a fluorescenza e acquisisci immagini delle tue preparazioni di cellule della punta radicolare.
2. Capire la Perdita del Controllo del Ciclo Cellulare Expand
   • NOTA: Prima che le cellule possano passare attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare, ci sono diversi punti di controllo che devono attraversare. Questi checkpoint sono regolati dalla ciclina e dalle proteine chinasi ciclina-dipendenti, o CDK. Se le cicline e le CDK determinano che i precedenti eventi cellulari non sono stati adeguatamente completati, arresteranno le cellule in questa fase e impediranno loro di proliferare. Nelle cellule tumorali uno o più di questi vincoli molecolari per la regolazione della divisione cellulare vengono persi e questo permette alle cellule danneggiate di sfuggire al controllo della proliferazione cellulare. Queste cellule anormali si sviluppano in tumori, che sono masse di cellule proliferanti incontrollate che interferiscono con le normali funzioni del corpo. Si noti come, prima di dividersi, questa cellula tumorale si arrotonda e rifrange la luce molto fortemente al microscopio ottico. Questo perché non tutte le cellule tumorali si dividono con successo in cellule figlie dopo ogni ciclo di mitosi. Ciò significa che spesso contengono un eccesso di organelli e DNA e questo aumento del contenuto cellulare significa che rifrangeranno la luce più intensamente rispetto alle cellule normali.
3. Risultati Expand
   • Esamina le immagini raccolte e registra nella Tabella 1 le diverse strutture cellulari e gli stadi che potrebbero essere identificati nella fetta di punta di cipolla che è stata trattata con nocodazolo. Clicca qui per scaricare la Tabella 1
   • Se ci sono cellule in fase di mitosi, nota quali fasi di divisione cellulare vedi.
   • Registra la percentuale di cellule in ogni stadio della mitosi nella Tabella 1.
   • Successivamente, esamina le immagini della fetta di cipolla non trattata e registra quali strutture cellulari riesci a identificare.
   • Se ci sono cellule in fase di mitosi, considera quali fasi della divisione cellulare vedi e registra le percentuali di cellule in ogni fase della mitosi nella Tabella 1.

L'ipotesi sperimentale è che nelle fette di punta della radice che sono state trattate con nocodazolo, una sostanza chimica che interferisce con la polimerizzazione microtubulare, tutte le cellule saranno arrestate nella stessa fase del ciclo cellulare e che nelle fette di punta della cipolla non trattate verranno visualizzate tutte le diverse fasi del ciclo cellulare. L'ipotesi nulla è che non ci saranno differenze nella mitosi tra i due gruppi e che verranno visualizzate diverse fasi del ciclo cellulare. Per prepararti a questo esperimento utilizzerai una cipolla che è stata messa in acqua per diversi giorni fino a quando non avranno iniziato a germogliare nuove punte di radici bianche.

Usa una lama di rasoio per tagliare un pezzo di un centimetro dall'estremità di una delle punte della radice. Metti la fetta di cipolla in una provetta da microcentrifuga etichettata N per la condizione di nocodazolo. Quindi tagliare un secondo pezzo di un centimetro di punta di radice di cipolla e metterlo in una provetta da microcentrifuga etichettata C per la condizione di controllo.

Aggiungere due microlitri di cinque milligrammi per millilitro di nocodazolo a un millilitro di acqua nella provetta per microcentrifuga etichettata N e un millilitro di acqua nella provetta etichettata C.Lasciare incubare le provette contenenti le punte delle radici per 12 ore e pulire l'area di lavoro con etanolo al 70%. Al termine dell'incubazione, impostare un blocco termico a 60 gradi Celsius. Lavare le punte trattate con nocodazolo con acqua e poi aspirare il liquido.

Ripetere questo lavaggio due volte per un totale di tre lavaggi. Riempire entrambe le provette con un millilitro di acido cloridrico normale. Incubare le provette in un blocco termico a 60 gradi Celsius per 12-15 minuti, quindi scartare l'acido in un pallone di scarto e aggiungere un millilitro di acqua distillata goccia a goccia nelle provette almeno tre volte per risciacquare i campioni.

Ora aggiungi un microlitro di colorante DAPI a 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi inserire 50 microlitri del colorante DAPI diluito in ogni provetta e lasciarli a temperatura ambiente per incubare per 12 minuti. Dopo questa preforma, tre lavaggi con acqua distillata, come appena dimostrato.

Etichettare un vetrino da microscopio come Controllo e un altro come Nocodazolo. Trasferire le radici colorate sui rispettivi vetrini da microscopio e aggiungere una goccia d'acqua al vetrino di controllo e una goccia di nocodazolo al vetrino di nocodazolo. Usa la lama del rasoio per rimuovere le parti non macchiate di ciascuna punta della radice e posiziona un vetrino di copertura su ogni campione.

Premere con cautela su ciascun vetrino coprioggetto con la punta di un dito guantato e poi lasciare riposare i vetrini per 10 minuti. Infine, visualizza i vetrini sotto l'obiettivo 40x di un microscopio ottico o fluorescente e acquisisci immagini delle tue preparazioni di cellule radicolari. Prima che le cellule possano passare attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare, ci sono diversi punti di controllo che devono attraversare.

Questi checkpoint sono regolati dalla ciclina e dalle proteine chinasi ciclina-dipendenti, o CDK. Se le cicline e le CDK determinano che i precedenti eventi cellulari non sono stati adeguatamente completati, arresteranno le cellule in questa fase e impediranno loro di proliferare. Nelle cellule tumorali uno o più di questi vincoli molecolari per la regolazione della divisione cellulare vengono persi e questo permette alle cellule danneggiate di sfuggire al controllo della proliferazione cellulare.

Queste cellule anormali si sviluppano in tumori, che sono masse di cellule proliferanti incontrollate che interferiscono con le normali funzioni del corpo. Si noti come, prima di dividersi, questa cellula tumorale si arrotonda e rifrange la luce molto fortemente al microscopio ottico. Questo perché non tutte le cellule tumorali si dividono con successo in cellule figlie dopo ogni ciclo di mitosi.

Ciò significa che spesso contengono un eccesso di organelli e DNA e questo aumento del contenuto cellulare significa che rifrangeranno la luce più intensamente rispetto alle cellule normali. Ora che tutti i dati sono stati raccolti, diamo un'occhiata ai nostri risultati. Quali strutture cellulari possono essere identificate nella fetta di punta di cipolla che è stata trattata con nocodazolo?

Ci sono cellule in fase di mitosi? Quali fasi della divisione cellulare vedi? Registrare la percentuale di cellule in ogni stadio della mitosi nella tabella.

Quindi guarda la fetta di cipolla non trattata. Quali strutture cellulari riesci a identificare? Ci sono cellule in fase di mitosi?

Quali fasi della divisione cellulare vedi? Registrare le percentuali di cellule in ogni stadio della mitosi nella tabella. Avrete notato che la maggior parte delle cellule nella fetta di cipolla trattata con nocodazolo si trovano nello stesso stadio di mitosi a causa delle proprietà di disgregazione dei microtubuli del reagente che impediscono la formazione delle fibre del fuso e la successiva segregazione cromosomica e divisione cellulare.

Tuttavia, nelle cellule della fetta non trattata sono visibili molti stadi diversi della mitosi, poiché la mitosi è un processo continuo negli organismi sani.