15.14: PCR

Panoramica

La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica ampiamente utilizzata per copiare segmenti di DNA. Grazie all’amplificazione esponenziale, la PCR può produrre milioni o miliardi di copie di DNA in poche ore. In una reazione PCR, un enzima di polimerasi del DNA resistente al calore amplifica il DNA originale attraverso una serie di variazioni di temperatura all’interno di una macchina automatizzata chiamata termociclo.

PCR è un metodo versatile che ha rivoluzionato la biologia molecolare

Kary Mullis ha sviluppato la PCR nel 1983, per la quale è stato insignito del Premio Nobel per la chimica nel 1993. Essendo un modo relativamente veloce, economico e preciso di copiare una sequenza di DNA, la PCR è diventata uno strumento inestimabile per numerose applicazioni, tra cui la clonazione molecolare, la mutagenesi genica, il rilevamento di patogeni, l’analisi dell’espressione genica, la quantificazione del DNA e il sequenziamento e la diagnosi delle malattie genetiche.

Il ciclo di reazione PCR

La PCR imita il processo di replicazione del DNA naturale che si verifica nelle cellule. La miscela di reazione include una sequenza di DNA modello da copiare, una coppia di molecole di DNA corto chiamate primer, blocchi di costruzione di DNA libero chiamati triplofati deossinucleotidi (dNTP) e un enzima specializzato di polimerasi del DNA.

La PCR comporta una serie di passaggi ad alte temperature, che richiedono un enzima di polimerasi del DNA che è funzionale a tali temperature. La polimerasi del DNA più comunemente utilizzata è la polimerasi Taq, dal nome della Thermus aquaticus, il batterio da cui la polimerasi è stata inizialmente isolata. La polimerasi del DNA non è in grado di sintetizzare una molecola di DNA da zero, o de novo. Invece, la polimerasi del DNA si aggiunge alle molecole di DNA corto, chiamate primer, che si legano al modello di DNA attraverso l’accoppiamento di base complementare. I primer forniscono un gruppo di idrossile gratuito da 3′ a cui la polimerasi del DNA può collegare nuovi dNTP. Ci sono quattro tipi di dNTP in una PCR, uno per ogni nucleotide nella molecola di DNA: dATP, dCTP, dGTP e dTTP.

Ogni ciclo di PCR è costituito da tre fasi: Denaturazione, Annealing e Sintesi del DNA.

1. Denaturazione. Il ciclo PCR viene avviato riscaldando la miscela di reazione ad una temperatura elevata, causando la separazione del DNA doppia elica in due fili. Questo processo di “fusione” di solito si verifica ad una temperatura di 90-100 gradi centigradi.
2. Ricottura. La miscela di reazione viene raffreddata rapidamente (di solito a 50oC–65oC), permettendo ai due primer di legarsi alle loro sequenze complementari sui filamenti di DNA del modello.
3. Sintesi del DNA (Estensione Primer). La miscela di reazione viene riscaldata di nuovo, questa volta ad una temperatura (di solito 60-75gradi) che consente alla polimerasi del DNA di estendere le primer aggiungendo dNTP che si accoppiano con le basi nel filo modello.

Una PCR tipica coinvolge 20-40 cicli ripetuti di questi tre passaggi, che si verificano nel termociclore. Poiché il numero di molecole di DNA è raddoppiato in ogni ciclo, il DNA viene amplificato in modo esponenziale.

Limitazioni della PCR

Se lo scienziato vuole amplificare un tratto specifico del genoma, lo scienziato deve conoscere almeno una parte della sequenza del DNA bersaglio per progettare i primer appropriati. Un altro potenziale problema è l’annessione non specifica dei primer a sequenze di DNA parzialmente simili, portando all’amplificazione del DNA non bersaglio. Questo problema può essere controllato ottimizzando le condizioni di reazione. Essendo un metodo di rilevamento altamente sensibile, la PCR è anche vulnerabile alla contaminazione e anche tracce di DNA contaminato possono causare risultati fuorvianti. Le polimerasi del DNA utilizzate nella PCR possono essere soggette a errori. Se una mutazione avviene entro i primi cicli, la maggior parte del DNA amplificato porterà la mutazione.