Cromatografia su colonna

Cromatografia su colonna

Esistono diverse tecniche per purificare e separare i composti in un laboratorio di chimica organica. Una delle tecniche di separazione più affidabili per le separazioni su microscala, in cui sono disponibili meno di 10 grammi del composto per l'analisi, è la cromatografia su colonna. Questa tecnica separa i composti in una miscela in base alle loro proprietà fisiche, come la solubilità, la polarità, l'idrofobicità, le dimensioni e la carica.

Nozioni di base sulla cromatografia

I componenti principali di qualsiasi sistema cromatografico sono la fase stazionaria, la fase mobile e la miscela di campioni da analizzare. Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria è tipicamente costituita da microsfere su microscala, che vengono impacchettate uniformemente in una colonna verticale. Un flusso continuo della fase mobile, nota anche come solvente, viene aggiunto alla sommità della colonna, che scorre attraverso la fase stazionaria per gravità o a una portata controllata da una pompa.

Il campione viene disciolto in una piccola quantità di solvente e quindi aggiunto alla parte superiore della colonna. Viene aggiunto altro solvente per forzare il flusso del campione attraverso la fase stazionaria. I composti nella miscela si dividono tra la fase mobile e la fase stazionaria in base alle loro diverse proprietà e formano bande discrete.

I composti con forti interazioni con la fase stazionaria si muoveranno più lentamente dei composti con deboli interazioni con la fase stazionaria. Pertanto, i composti con interazioni deboli usciranno dalla colonna, o eluiranno, prima di quelli con interazioni forti. La forza dell'interazione di un composto con la fase stazionaria è definita dal fattore di ritardo (R_f), che è il rapporto tra la distanza percorsa da un componente e quella percorsa dalla fase mobile. Il fattore di ritardo viene determinato eseguendo prima la cromatografia su strato sottile.

Un valore elevato del fattore di ritardo indica che il campione interagisce fortemente con la fase stazionaria e impiega molto tempo per eluire. Un valore basso del fattore di ritardo indica che il campione non interagisce molto fortemente con la fase stazionaria ed eluisce più rapidamente. Poiché i composti si dividono in bande individuali ed eluiscono dalla colonna in momenti diversi a causa dei loro diversi valori di R_f, possono essere isolati individualmente raccogliendo il solvente da sotto la colonna in frazioni.

Considerazioni sulla cromatografia su colonna

Una colonna cromatografica è un tubo di vetro o plastica orientato verticalmente. La dimensione della colonna può variare da pochi centimetri (come una pipetta Pasteur) a metri (come con le colonne industriali). Il diametro della colonna dipende dalla quantità di campione da separare, mentre la lunghezza della colonna dipende dalla difficoltà di separazione. Il partizionamento più efficiente in bande discrete richiede strati di campioni sottili; Pertanto, determinare il diametro appropriato è un passaggio fondamentale. Caricare troppo volume di campione rispetto al diametro della colonna creerà bande più larghe e meno definite rispetto allo stesso volume di campione in una colonna con un diametro maggiore.

Nella scelta della lunghezza della colonna, è necessario considerare i valori R_f dei componenti. I componenti con fattori di ritardo simili possono essere difficili da separare e richiedere una colonna più lunga per risolvere le singole bande. I composti con fattori di ritardo molto diversi potrebbero non aver bisogno di una colonna lunga, poiché dovrebbero partizionarsi facilmente. Quando si seleziona la fase stazionaria, è importante sceglierne una che comporti fattori di ritardo diversi per ciascun componente.

La preparazione della colonna è la parte più critica dell'esecuzione di una colonna cromatografica. La massa della fase stazionaria impacchettata nella colonna deve essere almeno 20 volte quella del campione. Se la colonna non ha un disco poroso nella parte inferiore, deve essere imballata con cotone e un sottile strato di sabbia. In questo modo si evita la perdita della fase stazionaria attraverso l'uscita della colonna.

Esistono due metodi per imballare la colonna: il metodo di confezionamento a secco e il metodo del liquame. Nel metodo a secco, la fase stazionaria viene trasferita nella colonna sotto forma di polvere. La colonna viene quindi lavata più volte con la fase mobile/solvente per garantire che il solvente penetri in ogni parte della colonna di gel di silice. Questo metodo, se non eseguito correttamente, può aumentare la probabilità che si formino macchie secche, canali e bolle d'aria nella colonna. Questi difetti influenzeranno la capacità della colonna di partizionare i componenti di una miscela.

Il metodo del liquame fornisce una colonna impaccata più uniforme che non contiene bolle d'aria, aree secche e canali. Per questo metodo, la fase stazionaria viene miscelata con un solvente per formare un impasto omogeneo. Il liquame viene quindi trasferito alla colonna picchiettando lateralmente per eliminare eventuali bolle d'aria formate. Il rubinetto della colonna, se presente, deve essere aperto durante questa fase per consentire il drenaggio del solvente.

Cromatografia su gel di silice

Molte proprietà diverse vengono sfruttate per separare una miscela di composti, come le dimensioni, la carica e l'idrofobicità. Una proprietà utilizzata per separare i composti in chimica organica è la polarità. Per questo, il gel di silice e il gel di allumina sono le fasi stazionarie più comunemente usate. Il gel di silice è estremamente polare e forma forti interazioni dipolo-dipolo con composti polari. Inoltre, il gel di silice può formare legami idrogeno con l'analita a causa della presenza di gruppi -OH sulla sua superficie.

I componenti della miscela che sono più polari si legano fortemente al gel di silice e viaggiano lentamente attraverso la colonna, mentre i componenti non polari sono più solubili nella fase mobile e viaggiano rapidamente attraverso la colonna. Pertanto, è essenziale che i componenti della miscela abbiano polarità diverse. I componenti che interagiscono fortemente con la fase stazionaria vengono eluiti facendo scorrere una fase mobile polare attraverso la colonna.

referenze

1. Shuler, M.L., Kargi, K., DeLisa, M. (2017). Ingegneria dei Bioprocessi, concetti di base. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall.
2. Harris, D.C. (2015). Analisi chimica quantitativa. New York, NY: W.H. Freeman e compagnia.

La cromatografia su colonna è una tecnica che utilizza una colonna impaccata per separare i composti in base alle loro interazioni con una fase stazionaria, che di solito è sotto forma di microsfere microscopiche. Gli spazi tra le perle sono riempiti con solvente. L'apertura della colonna consente al solvente di fluire attraverso la fase stazionaria. Quando una miscela viene applicata alla sommità della colonna impaccata seguita da una maggiore quantità di solvente, la miscela passa alla fase mobile e scorre attraverso la fase stazionaria.

Ogni componente della miscela interagisce con la fase stazionaria in modo diverso. Alcuni componenti hanno interazioni deboli con la fase stazionaria e quindi si muovono rapidamente attraverso la colonna, mentre altri hanno forti interazioni con la fase stazionaria e quindi si muovono più lentamente. Questo separa i diversi composti in bande, che vengono raccolte in piccole frazioni. Ciò consente la purificazione di ogni composto.

Quindi, che tipo di proprietà possono essere utilizzate per separare le miscele? Una delle proprietà più comunemente usate è la polarità. Per questo, il gel di silice, che è una forma di biossido di silicio, viene spesso utilizzato come fase stazionaria. Il gel di silice interagisce con i composti mediante interazioni dipolo-dipolo e legami idrogeno attraverso i gruppi -OH che si formano sulla sua superficie. Pertanto, i composti polari interagiranno fortemente con la fase stazionaria, mentre i composti non polari interagiranno debolmente.

Altre proprietà che possono essere sfruttate per la separazione includono le dimensioni, la carica e l'idrofobicità. Un modo comune per caricare la fase stazionaria nella colonna è come un impasto di fase stazionaria e solvente. Quindi, la fase stazionaria viene impacchettata facendo scorrere più solvente attraverso la colonna per compattare il liquame. È essenziale che la fase stazionaria sia impacchettata in modo uniforme senza bolle d'aria, canali vuoti o zone secche. Questi possono interrompere il flusso e causare la miscelazione delle bande.

Nella scelta di una colonna, il diametro si basa sul volume del campione da separare. Il campione dovrebbe coprire la parte superiore della colonna in uno strato sottile e uniforme. Uno strato di campione più spesso porta a bande più ampie. La lunghezza della colonna dipende da quanto bene i composti si separano nella fase stazionaria. I composti con affinità simili per la fase stazionaria richiedono una lunga colonna per un'adeguata separazione. Tuttavia, una miscela di composti con affinità molto diverse per la fase stazionaria può essere separata su una colonna più corta.

In questo laboratorio, esplorerai la cromatografia su colonna impacchettando e preparando prima una colonna di gel di silice. Quindi, utilizzerai la tua colonna per separare i componenti colorati nel colorante alimentare verde.