Questo protocollo descrive come generare elettrodi in fibra di carbonio. Gli elettrodi vengono successivamente utilizzate per rilevare rilascio di catecolamine dalle vescicole con amperometria in fibra di carbonio.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di elettrodi amperometrici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Elettrodi in fibra di carbonio sono cruciali per la determinazione del rilascio di catecolamine dalle vescicole in singole cellule per le misure amperometria. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per generare rumore basso (<0,5 pA) elettrodi. Le tecniche sono stati modificati dalle descrizioni pubblicato dai ricercatori precedenti (1,2). Gli elettrodi sono fatti con la preparazione delle fibre di carbonio e filettatura individualmente in ciascun tubo capillare utilizzando un vuoto con un filtro per aspirare la fibra. Successivamente, il tubo capillare con la fibra è tirato da un elettrodo estrattore, la creazione di due metà, ognuna con una punta sottile. Gli elettrodi sono immersi in acqua calda, epossidico liquido mescolato con catalizzatore per creare un sigillo di vetro-resina epossidica. Infine, gli elettrodi sono posti in un forno per curare la resina epossidica. Attenta gestione degli elettrodi è fondamentale per garantire che siano fatte in modo coerente e senza danni. Questo protocollo mostra come fabbricare e tagliare elettrodi amperometrici per la registrazione da singole cellule.
Protocollo
Parte 1: Preparazione fibra di carbonio
- Tagliare un fascio di fibre di carbonio (usiamo 7μm diametro) ad una lunghezza che è ~ 1,25 X la lunghezza della pipetta capillare.
- Rimuovere il dimensionamento ~ facendo bollire 100 ml di acetone in un contenitore e aggiungendo le fibre al caldo, acetone bollente per 30 minuti o più.
- Rimuovere fibre della acetone caldo, e trasferirli in un bicchiere pulito con 50-100 ml di acetone fresca.
- Fibre a secco ponendo il fascio su un piatto di 150 millimetri aperto Petri e airdry durante la notte.
Parte 2: Fuoco-lucidatura tubi di vetro capillare
- Fi....
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Discussione
Questo protocollo descrive come generare e tagliare elettrodi amperometrici. Durante le registrazioni amperometrica, un elettrodo di fibra di carbonio è posto contro la superficie di una cellula secretoria. Attività esocitotico si osserva come picchi amperometrico, che indica la corrente elettrochimica causata dal trasferimento di elettroni dopo l'ossidazione delle catecolamine. Con la pratica facendo e taglio elettrodi amperometrici, i livelli di rumore può essere notevolmente migliorato rispetto a molti degli elet.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Aaron P. Fox presso l'Università di Chicago, nel cui laboratorio di questo protocollo è stato originariamente progettato, e William Roden (Saint Louis University) per un ulteriore sviluppo del protocollo.
Ringraziamo la Fondazione Whitehall e National Science Foundation per il supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Scaglie di 1,3-fenilendiammina, indurente per resina epossidica | Reagente | Sigma-Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Gli aliquote sono conservati in un essiccatore e non devono essere esposti alla luce. |
| Fibre di carbonio | Materiale | Goodfellow | C005725 | |
| Capillari per microematocrito | Materiale | Fisher Scientific | NC9836768 | |
| Resina epossidica | Reagente | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Microscopio stereoscopico | Strumento | |||
| Tiratore di elettrodi | Strumento | Narishige International | PP-830 | Primo tiraggio = 24,8 gradi C; secondo tiraggio = 62,7 gradi C |
| Forno | Strumento | impostato a 100 gradi F | ||
| Piastra riscaldante | Strumento | impostata a 55 gradi C |
Riferimenti
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Metho....
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Ristampe e permessi
