Lo studio del comportamento motorio complesso in Drosophila melanogaster Dipende dalla capacità di quantificare i cambiamenti in movimento una mosca dato. Questo articolo viene illustrato come eseguire questa operazione utilizzando ad alta risoluzione sistema di tracciamento.
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Articolo metodologico
Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vola fornire un importante modello per lo studio del comportamento complesso a causa della pletora di strumenti genetici a disposizione dei ricercatori in questo campo. Studiare il comportamento motorio in
Protocollo
Parte 1: alimentazione e gestione delle mosche
- Vola deve essere coltivata in flaconi contenenti lievito senza supporti standard. Avrete bisogno di un gran numero di mosche, così croci bisogno di essere impostato di conseguenza. Vola deve essere coltivate in una 12-ore di luce: buio ciclo a 25 ° C.
- Le mosche devono essere raccolti subito dopo eclosion (1-3 giorni). Le mosche possono essere lavorato in questa fase utilizzando un diffusore di anidride carbonica, e deve essere ordinato in provette contenenti i media autoclavati o senza lievito. Noi usiamo solo i maschi, 10 memorizzati in una provetta.
- Attendere almeno un giorno o due dopo l'uso di anidride carbonica prima di eseguire gli esperimenti comportamentali. Corriamo vola nei nostri test comportamentali 3-5 giorni dopo Eclosion.
- Test deve essere sempre effettuata all'interno della stessa finestra 2-3 ore di tempo ogni giorno per evitare problemi di ritmo circadiano.
Parte 2: Installazione del sistema di tracciamento in un ambiente controllato
- Tutti gli esperimenti sono fatti in una stanza ambiente che mantiene una temperatura costante di 25 º C con il 70% di umidità.
- Sospendere una videocamera digitale sopra l'area da registrare (telecamera rivolta verso il basso). Poiché il nostro software di monitoraggio è invece basato, sospendiamo la fotocamera su un light box. La fotocamera registra video direttamente su un computer Dell tramite una connessione firewire. Noi usiamo una fotocamera Sharp video digitale, collegato ad un computer Dell con Windows Moviemaker (versione Vista) per l'acquisizione video.
- Impulsi di aria sarà somministrato in questo protocollo, quindi una fonte di flusso d'aria deve essere presente nella stanza. Utilizzando un tubo in gomma, collegare la sorgente d'aria per un filtro a carbone per la filtrazione dell'aria.
- Utilizzando un tubo in gomma di più, collegare l'altro lato del filtro a carbone per una beuta attraverso un tappo di gomma vuota, e riempire il pallone con circa un centimetro e mezzo d'acqua. Questo umidificare l'aria.
- Il pallone deve anche avere un arma da fianco, che si collegherà a forma di Y valvola tramite tubi in gomma.
- Un ramo della Y-valvola deve essere collegato ad un misuratore di portata. L'altro ramo deve fornire aria alla camera di locomozione piazza.
Parte 3: dare vola alla camera di locomozione
- La camera di locomozione piazza è basato sul design di Wolf et al. 2002 1, con l'aggiunta di vassoi piccola goccia per evitare che le mosche di volare all'interno della camera. La camera deve essere smontato, e tutti i componenti devono essere accuratamente pulito con etanolo al 70% e asciugato prima dell'uso.
- Anestesia immediatamente prima di effettuare un test comportamentale può potenzialmente compromettere le prestazioni. Per evitare questo, le mosche sono delicatamente bussato nella camera usando un imbuto con una presa di piccole dimensioni. Per fare una presa della misura giusta, allegare una punta blu pipetta (per P1000) alla fine di un imbuto. Usare le forbici per tagliare la fine del puntale per rendere l'apertura abbastanza grande per una mosca a passare attraverso.
- La parte superiore della nostra camera è un piccolo pezzo di plexiglass avvitato intorno ai bordi. Quando le viti vengono rimosse, i fori possono essere usati per fornire vola nella camera. Posizionare la parte superiore in plexiglass in modo che il foro della vite si trova direttamente sopra la camera interna al posto di una vite in cui si trova normalmente. Prendere una provetta contenente le mosche e metterlo a testa in giù sopra l'imbuto, che dovrebbe poi essere inserito nel foro della vite.
- Non spostare l'imbuto, in quanto ciò potrebbe ferire o danneggiare le mosche. Invece, dolcemente botto tutta la camera, imbuto e tutti, fino a che tutte le mosche sono all'interno della camera. Questo bussare dovrebbe essere fatto su un tappetino mouse per assorbire lo shock di questa sbattere. Quando le mosche sono all'interno, togliere l'imbuto, e riposizionare la parte superiore in plexiglass sopra i letti vite. Poi ri-avvitare la parte superiore in plexiglass in posizione.
Parte 4: Esecuzione del saggio locomotore
- Una volta che le mosche vengono caricati correttamente, far loro ambientarsi nella camera per 30 minuti. Questo periodo di acclimatazione deve avvenire in ambiente controllato (25 ° C, 70% di umidità), e la camera deve essere posto in cima al light box (che dovrebbe essere acceso). Accendere le luci stanza off.
- Dopo il periodo di acclimatazione, passare la Y-valvola nel sistema di flusso d'aria in modo che il flusso d'aria solo per il misuratore di portata. Accendere l'aria, l'aria e la rampa fino alla velocità desiderata (4,0-6,0 L / min). Generalmente usiamo 5,0-5,5 L / min, ma qualsiasi velocità in tale intervallo funzionerà.
- Una volta che la velocità desiderata è raggiunta, l'interruttore Y-valvola in modo che l'aria fluisce verso la camera di locomozione. Tempo questo impulso d'aria per 15 secondi, e poi girare bruscamente l'aria spenta. Come si accende l'aria spenta, accendere la fotocamera per registrare modalità. (Questa parte vuole pratica di fare tutto in una volta).
- Interrompere la registrazione dopo il tempo desiderato e SAVE. Registriamo 30 prove secondo a 10 fotogrammi al secondo (almeno 8 prove per genotipo).
Parte 5: Analisi dei Video
- Usiamo ilAnalisi dinamica del sistema di immagine (DIAS) 3.2 per il software di motion tracking 2. Per poter utilizzare questo software, che prima convertire i nostri video in un formato di file AVI con QuickTime 7.5.5.
- Per tracciare le mosche in base al contrasto, si usa il "AutoTrace da Threshold" funzione. Siamo quindi utilizzare il "Crea tracciato da traccia" funzione di digitalizzare queste tracce.
- Per emettere la velocità istantanea di ogni volo, si usa il "Compute Parametri" funzione di produrre un file di database (DIAS-specifico). Con questa funzione, abbiamo anche liscia i dati utilizzando un "5,15,60,15,5" Tukey Finestra levigante.
- Una volta che questa informazione è fornito come un file di database, può essere aperto in Microsoft Excel. Noi usiamo uno script Matlab per compilare la velocità istantanea all'interno di eccellere e di calcolare i parametri aggiuntivi necessari per comprendere la dinamica del movimento e la struttura incontro.
Rappresentante dei risultati:
La figura 1 mostra tracce rappresentante di organismi selvatici tipo Canton S (Figura 1, pannello a sinistra) e vola nullo per il gene dCASK cui sono stati generati dall'incrocio di due grandi delezioni sovrapposte (Df (3R) X307 e Df (3R) X313) (Figura 1 , a destra del pannello). mosche nullo dCASK precedentemente dimostrato di avere problemi locomotori con Paradigma di Buridano 3, e nel nostro paradigma, rispetto al Canton S, mostrano notevolmente ridotta locomozione. Abbiamo sempre gestito organismi wild-type prima per assicurarsi che le condizioni e il comportamento sono all'interno del range di normalità in un dato giorno. Abbiamo osservato deviazioni dalle risposte standard in meno del 5% dei giorni di test. Queste differenze di solito possono essere attribuiti a problemi con i parametri del nostro ambiente controllato.
Figura 1. DIAS generati tracce di entrambe le mosche Canton S wild-type (sopra, a sinistra) e Locomotore-deficienti Null dCASK vola generato da cancellature sovrapposte (sopra, a destra). Le tracce rappresentano ciò che si vede nel video registrati. Entrambe le tracce controindicazione immagini 8-10 vola per 30 secondi nel test di monitoraggio video che segue un impulso d'aria.
Figura 2. Vola tipo selvaggio sono stati eseguiti nel test locomotore (sopra) in seguito ad un impulso di aria (barre viola) e senza un impulso d'aria (blu). In tutti i parametri calcolati dal programma di analisi, non vi erano differenze significative tra le due condizioni (determinato con due code studenti t-test). Questo dimostra che in seguito ad un impulso di aria, vola locomote normalmente nel nostro setup.
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Discussione
Nella nostra impostazione, un impulso di aria moderatamente forte movimento si arresta temporaneamente volare. Quando l'aria pulsata termina, le mosche vengono rilasciati da questo stato stazionario e locomote normalmente, come mostrato in figura 2. Perché questo impulso di aria sincronizza in modo efficace locomozione della popolazione, lo usiamo per cominciare il processo in modo da poter anche studiare l'insorgenza del movimento a seguito di un momento di rottura stimolo. Il test può comunque essere fatto sen...
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01 GM54408 assegnato a LC Griffith. Vorremmo ringraziare Fred Wolf per il suo aiuto nel progettare la nostra camera di piazza e la creazione di nostri test, Frank Mello alla macchina negozio Brandeis University per costruire la nostra camera, e Dan Valente e Tim Lebestky per le conversazioni utili per quanto riguarda questioni di analisi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Camera Quadrata | Strumento | Officina Meccanica | N/D | Progettazione da Wolf et al. 20021 |
| Fotocamera Digitale | Fotocamera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flussimetro | Strumento | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Scatola Luminosa | Strumento | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Filtro al Carbone Attivo | Strumento | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/D | www.solltechnologies.com |
Riferimenti
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
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Ristampe e permessi
