Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Sommario

Il genoma del virus influenzale A si compone di otto complessi separati di RNA e proteine, chiamate complessi ribonucleoproteina virale (vRNPs). Questo documento descrive la purificazione gradiente glicerolo e microscopia elettronica visualizzazione trasmissione di influenza A vRNPs.

Abstract

L'influenza A genoma virale è costituito da otto-senso negativo, singole molecole di RNA, confezionati singolarmente con più copie del influenza A nucleoproteina (NP) in particelle ribonulceoprotein virale (vRNPs). Il vRNPs dell'influenza sono racchiusi all'interno della busta virale. Durante l'immissione delle cellule, tuttavia, questi complessi vRNP vengono rilasciati nel citoplasma, dove l'accesso al macchinario di trasporto nucleare host. Per studiare l'importazione nucleare di vRNPs influenza e la replicazione del genoma dell'influenza, è utile per lavorare con vRNPs isolato in modo che gli altri componenti del virus non interferiscono con questi processi. Qui, descriviamo una procedura per purificare queste vRNPs dal virus. La procedura inizia con la rottura del virione influenza A con detergenti al fine di rilasciare i complessi vRNP dal virione avvolto. Il vRNPs vengono separati dagli altri componenti del virione influenza A su una pendenza 33-70% glicerolo discontinuo per sedimentazione velocità. Le frazioni ottenuto dal gradiente di glicerolo vengono poi analizzati attraverso SDS-PAGE dopo colorazione con Coomassie blu. Le frazioni di punta contenenti NP sono poi sommati insieme e concentrato per centrifugazione. Dopo la concentrazione, l'integrità del vRNPs è verificata da visualizzazione del vRNPs tramite microscopia elettronica a trasmissione dopo colorazione negativa. La purificazione gradiente di glicerolo è una modifica di quella di Kemler

Protocollo

Parte 1: L'interruzione della Influenza A Virion

1. Aggiungere 750 ml di tampone MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in una centrifuga Beckman tubo di policarbonato (11 mm x 34 mm) progettato per adattarsi in un TLA-120,2 rotore per l'uso in Optima Beckman Max-E ultracentrifuga.
2. Aggiungere 500 ml di virus influenzale A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 ceppo; 2 mg / ml) in quel tubo. Mescolare il virus con il tampone MNT pipettando su e giù parecchie volte.
3. Centrifugare per 10 minuti a 109.000 xg, 4 ° C, in una Optima Max Beckman-E centrifuga con un TLA-120,2 rotore.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 microl....

Discussione

La purificazione di vRNPs si basa sulla procedura descritta da Kemler et al. (1994) ^1. Noi e gli altri hanno usato anche questo protocollo per isolare vRNPs di studiare la loro importazione nucleare. ^2,4,5

Si consiglia l'uso di RNasi-free suggerimenti e tubi durante la manipolazione vRNPs perché il genoma virale è costituito da RNA, e quindi facilmente degrada in presenza di RNA. Inoltre, tutti i buffer dovrebbe essere effettuato in acqua che è RNasi libero.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
H3N2 X-31 A / AICHI / 68 influenza A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glicerolo	Fisher Scientific	G33-1
Ottilglucoside	Sigma-Aldrich	O-8001
Lisolecitina	Sigma-Aldrich	L-4129
Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie blu brillante G-250	Kodak	1367796
trattata con pirocarbonato di dietil (DEPC)	Invitrogen	750024
Acetato di uranile	Ted Pella, Inc.	19481
Molibdato di ammonio	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuga	Beckman Coulter Inc.
Pacchetto rotore MLS-50, benna oscillante	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Gruppo rotore, angolo fisso, titanio	Beckman Coulter Inc.
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000