Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l'analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l'analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.
Articolo metodologico
Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Alta Content Analysis (HCA) saggi combinano le cellule e reagenti di rilevamento automatico e con immagini potenti algoritmi di analisi delle immagini, consente la misurazione di diversi fenotipi cellulari all'interno di un singolo test. In questo studio, abbiamo utilizzato HCA per sviluppare un nuovo metodo di analisi di neurotossicità. Neurotossicità di valutazione rappresenta una parte importante della valutazione sulla sicurezza dei farmaci, oltre ad essere un focus significativo degli sforzi di protezione ambientale. Inoltre, la neurotossicità è anche ben accettato
Protocollo
Preparazione delle cellule:
- Prima della semina delle cellule per i neuroni cultura saggio, / astrociti in terreni di crescita fino a ~ confluente 70-80% (a meno che la semina di cellule direttamente dal disgelo o isolamento).
- Staccare le cellule da fiaschi cultura / piastre tramite metodo appropriato per il tipo di cellule di interesse. Se necessario, cappotto pozzetti piastra con poli-D-lisina o di proteine della matrice extracellulare per migliorare l'adesione delle cellule. Co-colture di astrociti e neuroni possono essere seminate contemporaneamente o in sequenza. Per le teste di serie sequenziali, placcatura di astrociti prima come livello "basale" è consigliato, seguito da placcatura neuronale e la differenziazione, se necessario. Regolare la densità cellulare come appropriato per il tipo di cellule, il tempo della cultura successiva, i parametri di interesse, ecc A seconda dell'età della cultura, fonte di cellule e la densità di semina, colture primarie possono variare notevolmente in velocità di proliferazione, espressione di GFAP o crescita dei neuriti - è importante caratterizzare e ottimizzare il sistema cellulare ea garantire la rilevanza biologica per il modello sperimentale, così come per fornire efficaci per l'imaging, la segmentazione e l'analisi utilizzando HCS (vedi Figura 1). Dopo aver aggiunto le cellule a piastra (cellule possono essere seminate in 90 microlitri mezzi di comunicazione, di semplificare il trattamento tossina come descritto nel passaggio 3 di seguito), permettono di sedere piatto su una superficie piana a temperatura ambiente per 15-30 minuti, consentendo una distribuzione uniforme delle celle. Dopo questo periodo, le cellule incubare in terreni di coltura (37 ° C / 5% CO 2) per almeno 24 ore, quindi passare a condizioni di coltura differenziazione (per esempio, bassi livelli sierici / NGF per cellule PC12), a seconda dei casi. Continuare la cultura fino cellule raggiungere il livello desiderato di confluenza o di differenziazione, la sostituzione del supporto ad intervalli appropriati per il tipo di cellule.
- Trattamenti con le cellule (composti di controllo, composti di prova, ecc) può essere introdotto in qualsiasi momento durante questo periodo la cultura, come appropriato per il tempo-ciclo di trattamento di interesse. Acrilamide, perossido di idrogeno e K-252bis sono forniti come composti controllo neurotossici. Reagenti siano sufficienti per le curve di duplicare la dose di 12 punti risposta (di cui uno dH 2 O o DMSO-control trova all'interno del dose-risposta) per tutte e cinque le piastre a 96 pozzetti. I composti sono forniti concentrazione 250X (per K-252bis, assumendo una terapia massima di 1 microM) o 10X (di acrilamide e perossido di idrogeno, assumendo trattamenti massima di 100 mm e 10 mm, rispettivamente). Preparazione trattamento raccomandato coinvolge mezza log (1: √ 10) diluizione seriale del composto 250X in DMSO, seguita da diluizione in tampone di diluizione Compound a 10 volte (10 volte composti controllo originari dH 2 O può essere diluito in serie direttamente in sterili dH 2 O o di diluizione Compound). 10 L di ogni trattamento può poi essere aggiunto al 90 microlitri di terreni di coltura già presenti in ciascun pozzetto, per una concentrazione finale 1X (0,4% o al 10% DMSO dH 2 O). Dati di esempio viene fornito per 24 o 96 ore di trattamento composto a 37 ° C prima della fissazione.
Fissazione e colorazione delle cellule immunofluorescenza:
Nota: il tempo di colorazione è ~ 2,5 ore dopo la fissazione. Non permettere pozzetti si asciughino tra i passaggi colorazione. Aspirazione e dispensazione dei reagenti deve essere condotta a basse portate a diminuire la perdita di cellule dovuta al taglio del fluido. Tutti raccomandati 'per bene' i volumi si riferiscono a un singolo pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti. Tutti raccomandati 'per 96 pozzetti' volumi includono il 25% la perdita di liquido in eccesso di volume di movimentazione. Tutte le fasi di colorazione vengono eseguite a temperatura ambiente (RT). Tutti i tamponi e le soluzioni di anticorpi sono stabili per almeno 24 ore a temperatura ambiente.
- Alla fine del periodo di coltura, pre-riscaldare Soluzione Fissazione HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) o di 37 º C se lo si desidera (12 piastra mL/96-well). In una cappa, aggiungere 100 l / pozzetto direttamente ai terreni di coltura e consentono di fissare per 30 minuti a RT. Rimuovere fissativo / tossina contenenti i media e smaltire in conformità alle norme per i rifiuti pericolosi (vedi scheda di sicurezza). Se procedere immediatamente alle macchie, lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di tampone HCS immunofluorescenza. In alternativa, se le targhe devono essere colorati in un secondo momento, lavare due volte con 200 ml di soluzione di lavaggio, quindi lasciare secondo risciacquo volume in pozzi e piastre di conservare ben chiusi a 4 ° C fino a colorazione.
- Se i campioni sono stati conservati fisso a 4 ° C prima della colorazione, lavare due volte con 200 microlitri Buffer HCS immunofluorescenza prima di procedere con il protocollo di colorazione.
- Preparare soluzione di lavoro di coniglio anti-tubulina βIII / Mouse anti-GFAP Anticorpi HCS primaria (6 piastra mL/96-well) come segue: Aggiungere 60 ml di ogni anticorpo primario scongelati a 5,88 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene. Rimuovere precedenti Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di soluzione di anticorpo primario in ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere Anticorpo primariosoluzione. Lavare tre volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza.
- Preparare la soluzione di lavoro di anticorpi HCS secondaria / Hoechst HCS nucleare Stain (6 piastra mL/96-well) come segue: aggiungere 30 ml di ogni anticorpo secondario scongelati e 30 ml di scongelato Hoechst HCS nucleare Stain a 5,91 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene, proteggendo la soluzione dalla luce. Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di anticorpo HCS secondaria / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Rimuovere HCS secondaria Anticorpo / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain. Sciacquare due volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza.
- Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Sciacquare due volte con 200 ml di tampone HCS lavaggio, lasciando secondo risciacquo volume in pozzi.
- Piatto di tenuta e di immagine subito, o conservare a 4 ° C al riparo dalla luce fino al momento per l'imaging.
Acquisizione di immagini e analisi:
- Imaging e analisi di piatti colorati possono essere eseguite su una varietà di piattaforme disponibili HCS, tra cui il IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher scientifico) o Opera (Perkin Elmer). Alcune linee guida per l'imaging e di analisi sono riportati nella Tabella 1:
| HCS222 Image Acquisition Linee guida | |||
| Rilevazione dei reagenti | Obiettivo obiettivo | Intervallo di eccitazione Filter [picco / larghezza di banda (nm)] | Intervallo di emissione Filtro [picco / larghezza di banda (nm)] |
| Hoechst HCS nucleare Stain | 20X | 360/40 | 460/40 (o 535/50 se necessario) |
| HCS anticorpo secondario, coniugati con Donkey anti-IgG | 20X | 480/40 | 535/50 |
| HCS anticorpo secondario, Cy3-Donkey anti-mouse IgG | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 Image Analysis Linee guida | |||
| Cella di | Rivelazione | Segmentazione / misurazione | Fondamento logico |
| Numero di cellulare, Caratteristiche nucleare | Hoechst HCS nucleare Stain | Regione nucleare (460 nm di emissione del canale). Contare il numero di nuclei. Contenuto di DNA (intensità nucleare) o analisi settore nucleare sono inoltre possibili. | Usa numero cellulare, caratteristiche nucleari per determinare la perdita di cellule, fenotipi tossicità, ecc Può nuclei "filtro" per quelli associati βIII-tubulina o espressione GFAP di ottenere separare conta delle cellule neuronali e astrocitaria / caratterizzazioni (fortemente consigliato). |
| βIII-tubulina di espressione, neuriti escrescenza | HCS anticorpo secondario, coniugato FITC | Regione citoplasmatica (535 nm di emissione del canale). Segnale FITC possono essere utilizzati per distinguere corpi cellulari neuronali da neuriti (ad esempio, attraverso le zone delle cellule minimo / medio corpo, la lunghezza dei neuriti minimo / massimo e larghezza). Determinare parametri quali la lunghezza dei neuriti totale, conta neuriti / cellulari, ecc | Misure crescita dei neuriti può essere modulata durante la differenziazione neuronale o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can "filtro" corpi cellulari per quelli associati βIII-tubulina espressione di ottenere distinte caratterizzazione neuronale (fortemente consigliato). |
| GFAP Espressione, Area astrociti | HCS anticorpo secondario, coniugato con Cy3- | Regione citoplasmatica (600 nm di emissione del canale). Cy3 segnale può essere utilizzato per definire astrocitaria segmentazione citoplasmatica. Determinare parametri come intensità media del segnale citoplasmatici, area delle celle, ecc | Espressione di GFAP e la zona delle cellule astrociti possono essere modulata durante lo sviluppo degli astrociti o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can "filtro" corpi cellulari per quelli associati con l'espressione di GFAP di ottenere distinte caratterizzazione astrocitaria (fortemente consigliato). |
. Tabella 1 Immagine Linee guida acquisizione e l'analisi - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Cultura) Assay
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluoreScence misti di colture di cellule neuronali di ratto.
Co-colture di astrociti primari di ratto sia con i neuroni dell'ippocampo di ratto primaria dell'ippocampo di ratto o cellule PC12 sono state generate dalla pre-placcatura astrociti per diversi giorni di cultura, seguito da semina neuronale. Neuroni primari sono state coltivate per altri 11 giorni, mentre PC12s sono stati coltivati per altri 2 giorni in condizioni di differenziazione (bassi livelli sierici / NGF). Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neuroni primario) o 10X (PC12) ingrandimento obiettivo e analizzati utilizzando il GE IN Workstation cellulare Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target Pannello superiore.: immagini fuse di Hoechst HCS Stain nucleare (blu), βIII-tubulina (verde) e GFAP (rosso) fluorescenza. Analisi separata dei βIII-tubulina canale di fluorescenza permette di segmentazione crescita dei neuriti (al centro del pannello: corpi cellulari delineate nel blu (neuroni primari) o giallo (PC12), neuriti in verde (neuroni primario) o azzurro (PC12)). Analisi del canale GFAP permette di segmentazione astrociti (pannello di fondo: i nuclei in blu, citoplasma in verde). Segmentazione GFAP per il primario dei neuroni dell'ippocampo di ratto / astrociti co-coltura dimostra la capacità di distinguere tra nuclei / celle corpi che sono GFAP (+) (verde contorni) e quelli che sono GFAP (-) (rosso), che consente la conta delle cellule separate per neuroni e astrociti in un ambiente cultura mista. 
Figura 2. Risposte dose di primari di ratto neurone dell'ippocampo / astrociti co-colture agli stress tossico.
Astrociti primari di ratto dell'ippocampo (P6) sono stati placcati in piastre a 96 pozzetti in terreni di coltura e coltura per 6 giorni. Neuroni dell'ippocampo di ratto primario (diretto da disgelo) sono poi stati seminati in cima alla pre-plated astrociti e coltivate in terreni di coltura per 11 giorni. Le cellule sono state trattate con diluizioni seriali di perossido di idrogeno o acrilamide (concentrazione max = 100mm e 10mm, rispettivamente) per le ultime 24 ore di cultura. Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campi / pozzetto) ed analizzati (nucleare / citoplasma / segmentazione dei neuriti) utilizzando il cellulare di GE IN Workstation Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target. I dati presentati sono media ± SEM, n = 3. Più parametri (crescita dei neuriti, intensità GFAP, zona astrociti e conta delle cellule neuronali o astrociti) sono stati indagati per dose-dipendente tendenze.
Discussione
Fino ad oggi, in esperimenti in vitro progettato per studiare la valutazione del rischio di neurotossicità utilizzando colture miste di neuroni e astrociti sono stati limitati. E 'ben accettato che le cellule gliali sono parte integrante nel fornire supporto spaziale e metabolico ai neuroni, e svolgono un ruolo cruciale nel modulare diverse funzioni neuronali, compresa la migrazione neuronale, la differenziazione e l'attività sinaptica. Astrociti gliali anche rilascio di citochine e altri fattori solubili, che sono in grado di indurre sia tolleranza effetti avversi su tessuti circostanti neuronale, oltre a promuovere neuronale di molte tossine. Dimostrare la profondità dei neuroni-gliali interazioni, in co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro la tossicità di stress ossidativo, mentre l'alterazione delle funzioni astrociti, come la manutenzione di difesa antiossidante ed i livelli di energia cellulare, è stato dimostrato che criticamente influenzano la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l'uso di astrociti in una neurotossicità in vitro di test del sistema può rivelarsi più rilevanti per la salute umana struttura del sistema nervoso centrale e la funzione di cellule neuronali da solo. Nonostante la crescente consapevolezza del significato fisiologico di neuroni, astrociti interazioni, è già stato difficile effettuare analisi quantitative di queste interazioni in cellule intatte. L'avvento di screening ad alta Contenuto consente lo sviluppo di potenti nuove analisi per affrontare questo.
In questo studio, abbiamo dimostrato che le analisi quantitative di più fenotipi neuronali e astrociti all'interno di un singolo test sono rese possibili da HCA. Nei neuroni primari abbiamo effettuato misurazioni quantitative dei marcatori di neurotossicità quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti. Negli astrociti, gliosi reattiva è un biomarker noto di neurotossicità, caratterizzata da alterazioni nell'espressione GFAP, il numero di astrociti e la morfologia degli astrociti. Abbiamo dimostrato che ognuno di questi endpoint possono facilmente essere valutata tramite HCA. Questi studi supportano il concetto che HCA di neurali specifici biomarcatori potrebbe essere utilizzato come parte di una batteria di test in vitro per lo screening rapidamente un gran numero di sostanze chimiche per gli endpoint neurotossici.
Millipore HCS222 Alta kit Content Analysis per co-coltura di neuroni e astrociti si compone di alta qualità, reagenti e protocolli per il rilevamento simultaneo profilazione βIII-tubulina e proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) in una vasta gamma di modelli cellulari di neurotossicità. La altamente convalidato reagenti forniti con questo kit consentono all'utente di standardizzare i test, ridurre al minimo dosaggio a dosaggio variabilità, riproducibile e per generare immagini con un elevato rapporto segnale-background rapporto.
Dichiarazioni
Gli autori sono tutti i dipendenti di Millipore Corporation.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Drs. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matteo Hsu, Jehangir Mistry e Michele Hatler per il supporto durante lo sviluppo di questi progetti e protocolli.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo primario HCS anti-βIII-tubulina da coniglio, 100X | Numero di parte CS201672 | 1 flacone contenente 300 μL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Anticorpo secondario HCS (IgG da asino anti-coniglio, coniugato FITC), 200X | Numero di parte CS201649 | 1 flacone contenente 150 μL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Anticorpo primario HCS anti-GFAP da mouse, 100X | Numero di parte CS201671 | 1 flacone contenente 300 μL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Anticorpo secondario HCS (IgG da asino anti-mouse, coniugato Cy3), 200X | Numero di parte CS200437 | 1 flacone contenente 150 μL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Colorante nucleare H–chst HCS, 200X | Numero di parte CS200438 | 1 flacone contenente 150 μL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Soluzione di fissazione HCS con rosso fenolo, 2X | Numero di parte CS200434 | 1 bottiglia contenente 100 mL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Tampone per immunofluorescenza HCS, 1X | Numero di parte CS200435 | 1 bottiglia contenente 1000 mL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Tampone di lavaggio HCS, 1X | Numero di parte 2007643 | 1 bottiglia contenente 500 mL Componenti del kit Millipore HCS222 | |
| Acrilamide (composto di controllo), 10X | Numero di parte CS201679 | 1 flacone contenente 500 μL di acrilamide 1M in dH2O Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Peroxido di idrogeno (composto di controllo), 10X | Numero di parte CS201730 | 1 flacone contenente 500 μL di perossido di idrogeno 100 mM in dH2O Componenti del kit Millipore HCS222 | |
| K-252a (composto di controllo), 250X | Numero di parte CS201741 | 1 flacone contenente 100 μL di K-252a 250 μM in DMSO Componente del kit Millipore HCS222 | |
| DMSO per diluizione seriale del composto | Numero di parte CS200441 | 1 bottiglia contenente 10 mL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Tampone per diluizione del composto | Numero di parte CS200442 | 1 bottiglia contenente 25 mL Componente del kit Millipore HCS222 | |
| Sigillanti per piastre | Numero di parte CS200443 | 10 pezzi Componenti del kit Millipore HCS222 | |
| Piastre microtitolazione con fondo nero/trasparente trattato per coltura cellulare | |||
| Sistema di imaging/analisi HCS |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
