Summary
Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.
Abstract
Yaşlanma, hücresel bileşenleri ve ölüm ile sonuçlanan organelleri ilerleyici bir bozulma ile karakterize dejeneratif bir süreç. Maya
Protocol
Bölüm 1: replikatif ömrü analizi için suşları ve plakalar hazırlayın
Bu bölümde, replikatif ömrü deneyi ve ömrü analiz için maya hücreleri hazırlanmasında kullanılmak üzere sağlam YEPD tabak hazırlanması açıklamaktadır.
- Uygun steril tekniği kullanarak, kültür maya hücreleri ve replikatif ömrü analizi için kullanılacaktır YEPD agar plakları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) hazırlar. Ömrü deneyi analiz edilmesi için her 4-5 suşları için en az 2 tabak hazırlamak gerekir. Plakalar ömrü deneyden önce en az 2 gün önce hazırlanan ve ömrünü tahlil başlamadan önce kurumasına izin olmalıdır. Deney plakaları dökme 4-5 gün içinde yapılması durumunda, soğutmalı inkübatör yerleştirilir ve parafilm sarılmış veya kuruma önlemek için plastik olmalıdır.
- YEPD agar plakları üzerine tek koloniler için dondurulmuş hisse senetleri ve çizgi maya suşları çıkarın. 6 suşları kolayca eşit büyüklükteki pasta şeklinde takozlar plaka bölümleme aynı YEPD plaka çizgili olabilir.
- Hücreler, 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
- Inkübatör ve tek bir koloni yama hücreleri hücreleri, taze bir YEPD tabağa çıkarın. Iki farklı koloniler İki yamalar her bir suş için oluşturulan olmalıdır. Bu zamanda, analiz edilecek suşların dissectors bireysel suşlarının kimliğini bilmiyorum replikatif ömrü deney, "kör" yapılır sağlamak için kodlanmış olmalıdır.
- Aşağıdaki akşama kadar 30 yamalı, kodlu hücreleri ° C inkübe edin.
- Replikatif ömrü analizi için kullanılan deneysel bir tabak olarak hizmet verecek taze YEPD plakaları her kodlu gerginlik hücreleri ve hafifçe yama hücreleri çıkarın. Hücreler YEPD plaka (Şekil 1) sol tarafta dikey bir çizgi boyunca yamalı olmalıdır. Plaka başına yaklaşık 3-5 yamalar her yama 20 hücre replikatif ömrü analizi varsayarak, en uygunudur. Bu hücrelerin sonraki replikatif ömrü sınırlayabilir gecelik inkübasyon sırasında kalın büyümeye neden olarak, taze YEPD plaka hücrelerin çok sayıda transfer etmek için (ne de arzu edilir) gerekli değildir.
- Geceleme tezgah üstüne taze yamalı plakaları inkübe edin.
Bölüm 2: replikatif ömrü analizi için pozisyon hücreleri.
Bu bölümde, maya hücreleri ve plaka nasıl replikatif ömrü analizi için bakire kızı hücreleri elde etmek için nasıl konumlandırmak için açıklar. Bu noktadan itibaren, tüm plakaları kuruma önlemek için diseksiyonu uygulanan durumlar dışında, parafilmed olmalıdır.
- Maya uygun bir mikrodiseksiyon cihazları ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ilk yamalı gerginlik yaklaşık 50 hücreleri, yamalı hücreleri distal plaka bir konuma aktarın. Mikroskop sahne derecelendirildi ise hücreleri sonraki iterasyon sırasında bulmak kolay olacak, bu geçişleri sağlamak için kullanılabilir. Zeiss Axioscope 40, ilk yamalı gerginlik hücreleri koordinatları 90 x 10 yerleştirilir ve oradan dikey olarak dizilmiş.
- Art arda agar yüzeyine dokunarak hücre iğne temizleyin, sonra agar agar yüzeyi boyunca iğne zorlayarak bir delik oluşturmak. Bu delik, diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka üzerinde yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet edecektir. Delik maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun.
- Doğrudan delik üzerinde, dikey, her hücre pozisyonlar (Şekil 1) arasında 1-3 iğne çapları (~ 100 mcM), 20 eşit aralıklı pozisyonlara bireysel maya hücreleri hizalamak. Her birkaç hücreler, birbirine bitişik iki hücre yerine birden paralel olarak aynı konumda yerleştirin. Devredilen hücreleri bölmek için başarısız olursa, bu, bakire kızı hücre seçimi sırasında artıklık sağlar.
- 10. ve 11. pozisyonu doğrultusunda arasında, agar 7-8 delik yatay bir dizi oluşturmak. Bu diseksiyon ve yavru hücre çıkarılması sonraki iterasyon sırasında plaka yönlendirmek sizin için bir işaretleyici olarak hizmet verecek. Deliklere maya hücreleri elde etmek için ya da büyüyecek ve bir koloni formu dikkatli olun.
- Tekrar aynı eksen boyunca dizi hücreleri dikey devam plaka üzerinde her yama için 2,1-2,4 adımları. 2.2 adım için, oluşturulan delik yama sayısı (ilk yama için bir delik, ikincisi için iki delik, vb.) Uygun olmalıdır.
- Bir keresinde hücreleri parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat boyunca, her yama için dizilmiş edilmiştir.
- Deneyde, her plaka için 2,1-2,6 adımları tekrarlayın.
Bölüm 3: ömrü analizi için elde bakire kızı hücreleri
Bu bölümde, her hücre bir bakire kızı olarak başlar sağlayarak ömrü analizi başlatmakhücresi.
- Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün.
- Ilk dizilmiş hücre ile başlayarak, ana hücreden yavru hücrelere bağlı hücrelerin üstüne hafifçe iğne koyarak ayırmak için iğne kullanın. Bu iğne hücreleri üzerinde dinlenme ise mikroskop tabanı yan dokunun bazen yararlı olabilir.
- Ana hücre ve herhangi bir ek kızı hücrelerinin yerine, geçici olarak bir kenara taşıyarak dikey çizgi müstakil yavru hücre yerleştirin.
- Dizilmiş hücrelerin her biri için 3.2 ve 3.3 adımı yineleyin. Bir hücre bölmek için başarısız olursa, adım 2.3 'de yer gereksiz hücreler biri bir kızı hücre alır. Bittiğinde, ömrünün plaka üzerine dikey hizalanmış her yama için 20 yavru hücreye sahip olmalıdır.
- Yığınına anne hücreleri ve ilave kızı hücreleri toplamak ve yamalar yakın bir alanda ("mezarlık") geri aktarabilirsiniz. Kadar ömrü analizi mikrokoloniler ve yerel besinlerin tükenmesi oluşumunu engellemek için uygulanan hücrelerin istenmeyen hücrelerin tutmak için önemlidir.
- Parafilm plaka ve inkübe 30 ° C yaklaşık 2 saat.
- Deneyde, her plaka için 3,2-3,6 adımları tekrarlayın.
Bölüm 4: Ölçüm tek tek hücrelerin replikatif kapasitesi
- Ömrü veri sayfaları hazırlayın. Bir ömrü veri sayfası, her satırı ayrı bir anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş-noktası (Şekil 2) karşılık gelen basit bir kılavuz olabilir. Analiz edilecek suşların sayısına göre her bir veri sayfasının etiketleyin.
- Inkübatör plakaları çıkarın ve dizilmiş hücreler çoğu en az bir hücre bölünmesi uğramadığını kontrol edin. Hücre bölünmesi tamamlanmış olmasını sağlamak için ek süreye ihtiyaç duyulması halinde, inkübatör plaka dönün.
- Ilk plaka üzerine dizilmiş ilk hücre ile başlayarak, anne ve yavru hücre (ler) görsel olarak gözlemlemek ve meydana gelen hücre bölünmeleri sayısını belirlemek. Bir anne, cep düzenlemelerin karakteristik kalıplarına dayalı üretti kaç kızı hücreleri belirlemek için genellikle kolaydır. Ömrü puan kağıda uygun kutuya ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye numarasını kaydedin.
- Adım 3.2 'de açıklandığı gibi ana hücreden kızı hücreleri ayırmak için iğne kullanın.
- Dikey çizgi konumunu anne hücre saklayın ve bir kenara geçici olarak yavru hücre (ler) taşımak.
- Dizilmiş hücrelerin her biri için 4,3-4,5 adımları tekrarlayın.
- Atılır kızı hücrelerinin tümünü toplayın ve orijinal yamalar yakınında bulunan 'mezarlık' taşıyabilirsiniz.
- 30 Parafilm plaka ve inkübe ° C 2-3 saat.
- Deneyde, her plaka için 4,3-4,8 adımları tekrarlayın.
- Tüm anne hücreleri bölünerek geçinceye kadar tekrarlayın 4,2-4,9 adımları. Hücrelerinin annenin yaşı gibi, hücre döngüsünün ilerlemesi daha yavaş olur ve bu yaş noktaları arasında daha uzun süre için plaka inkübe arzu olacaktır. Plakalar 4 ° C gecede yerleştirilebilir.
Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar.
Replikatif ömrü deneyi tarafından üretilen ham veriler, her yaş-noktası (Şekil 2) Her bir ana hücre tarafından üretilen yavru hücreye karşılık gelen bir liste numaraları. Puan sayfasının her satır toplayarak, her anne hücre için replikatif ömrü elde edilir. Veri aynı deney grubu anne hücreleri için bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 3A) oluşturmak ve ortalama yaşam süresi, ortalama yaşam süresi, ve standart sapma gibi istatistiksel hesaplamalar gerçekleştirmek için toplanmış olabilir. Wilcoxon Rank Sum testi gibi non-parametrik bir test, deney grupları arasında tespit ömrü önemli farklılıklar olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Deney düzgün çalışır, hayatta kalma eğrisi düşük erken mortalite ile sigmoidal Shap gösteren Gompertz-Makeham kinetik ile görece hızlı bir gerileme ve bir yaşam eğrisinin düzleşme dışında daha geç yaşlarda takip kabaca tutarlı olmalıdır. Bu aralıkta değişimi dışında olmasına rağmen, en vahşi-tip suşlar, 20-30 nesil aralığında replikatif ömrü değerleri var.
Şekil 1. Tipik bir replikatif ömrü plakası diyagramı. Maya hücrelerinin mikrodiseksiyon başlamadan önce akşam, 3-5 suşları plakanın bir tarafı hafifçe boyunca dikey bir çizgi (kırmızı kutu) YEPD plaka yüzeyine yamalı vardır. Gecede büyümesinin ardından, her bir suş yaklaşık 30 ayrı hücreler 20 pozisyonları içeren bir satır içine dikey olarak dizilmiş. Life a analysiler bu ilk hücreleri elde v bakire kızı hücreleri üzerinde yapılacaktır. Koloniler olarak besin yerel tükenmesi önlemek için uzak deneysel hücreleri yer almaktadır "mezarlık" (gri oval), deney sırasında (örneğin istenmeyen kızı hücreleri) mikrodiseksiyon elde Ekstra hücreleri yerleştirilmiştir.
Şekil 2. Bir replikatif ömrü taksitli sayfalık bir replikatif ömrü deneyi Ham veri gösterilmiştir. Her satır, tek bir maya anne hücreye karşılık gelir ve her sütunun bir yaş noktasına karşılık gelir. Her kutuda girilen numarayı bu yaş noktada o ana hücre tarafından üretilen kızı hücrelerinin sayısı. Her suş maya hücreleri diseksiyon bireysel analiz edilen suşların kimliğini hiçbir bilgiye sahip olduğunu kodlu bir numara ile etiketlenir. Yirmi hücrelerin her bir suş için test.
Şekil 3. Replikatif ömrü deneyi Temsilcisi hayatta kalma ve büyüme eğrileri (A), (hücre bölünmesi sayısı. Replikatif yaş bir fonksiyonu olarak hala hayatta anne hücreleri kısmını komplo ile elde edilen sağkalım eğrileri (B) Büyüme eğrilerinin çizilmesi ile elde edilir . Bu örnekte yaş noktasının bir fonksiyonu olarak belirli bir suş tarafından üretilen yavru hücreye ortalama sayısı., gerginlik # 2 uzun ömürlü ama daha yavaş büyüme komplo azaltılmış ilk eğimi ile kanıtlandığı gibi, büyüyen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, MK ve BKK Ellison Tıp Vakfı için bir hibe ile desteklenmiştir. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar. Biz çekimler sırasında yardım almak için Soumya'den Kotireddy teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Bacto-Peptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) | |
| Glucose |
References
- Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K.
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).
- Smith, E. D. Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species. Genome Res. 18, 564-570 (2008).
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).
- Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast. Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast. PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).
- Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae. Science. 289, 2126-2128 (2000).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).
- Kaeberlein, M. Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients. Science. 310, 1193-1196 (2005).
