Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di fluorescenza In situ sugli spermatozoi umani. Le preparazioni ottenute possono essere utilizzate per lo screening aneuploidia nel contesto della diagnosi clinica.
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Articolo metodologico
Fluorescenza In situ (FISH) Protocollo di sperma umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Aneuploidie sono le più frequenti anomalie cromosomiche negli esseri umani. La maggior parte di queste anomalie derivare da errori durante il processo meiotico gametogenic nei genitori. Nei maschi umani, questi errori possono portare alla produzione di spermatozoi con anomalie cromosomiche numeriche che rappresentano un aumento del rischio di trasmissione di queste anomalie alla prole.
Per questo motivo, la tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei degli spermatozoi è diventato un protocollo ampiamente adottato nel contesto della diagnosi clinica. Questa pratica fornisce una stima della frequenza di anomalie cromosomiche numeriche nei gameti dei pazienti che cercano di consulenza genetica riproduttiva.
Ad oggi, i cromosomi più frequentemente inclusi nell'analisi dello sperma FISH sono cromosomi X, Y, 13, 18 e 21.
Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare e fissare un campione di sperma umano, come decondense e denaturare la cromatina spermatica, come procedere per ottenere preparazioni FISH spermatozoi, e come visualizzare i risultati al microscopio. Note particolari delle operazioni più rilevanti sono dati per ottenere i migliori risultati.
Protocollo
I. Trattamento dei campioni e la fissazione delle cellule
- Lasciare il campione di seme in contenitori sterili a temperatura ambiente per 20 minuti fino a liquefazione.
- Trasferire il campione in una provetta da centrifuga e spin è a 1000g per 5 minuti.
- Rimuovere delicatamente e scartare il surnatante con una pipetta Pasteur.
- Aggiungi una soluzione ipotonica (KCl, 0.075M) pre-riscaldato a 37 ° C, goccia a goccia, mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 10 ml.
- Porre il tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 minuti.
- Centrifugare a 1000g per 5 minuti. Eliminare attentamente il supernatante....
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Discussione
Questo protocollo descrive come trattare i campioni di sperma umano per ottenere preparazioni FISH spermatozoi. Utilizzando questo protocollo è possibile analizzare le anomalie cromosomiche nei gameti maschili. Spermatozoi di screening aneuploidia ha applicazioni sia nel contesto della ricerca di base e nei consigli riproduttiva dato ai maschi infertili. Anche se nella diagnosi clinica dei cromosomi più studiati sono X, Y, 13, 18 e 21, altre sonde commerciali per una vasta gamma di cromosomi e loci sono disponibili e po.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano a J. Blanco e F. Vidal per la loro supervisione e incoraggiamento, e J. Lucas per la sua assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Ditiotreitolo (DTT) | Materiale | Gruppo Roche | 10197777001 | |
| 2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propanediolo | Materiale | Gruppo Roche | 10708976001 | |
| Acido acetico | Materiale | Merck && Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Kit per sonde DNA multicolore
| Materiale | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| Centrifuga 5804R | Strumento | Eppendorf | ||
| Tubo da centrifuga | Materiale | Nalge Nunc international | 347856 | |
| barattolo Coplin (in vetro) | Materiale | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| barattolo Coplin (in plastica) | Materiale | Deltalab | 191087 | |
| Coverslip (15x15) | Materiale | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Coverslip (18x18) | Materiale | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Matita diamantata | Materiale | Hammacher | 335117010 | |
| Etanolo | Materiale | Merck && Co., Inc. | 100.983 | |
| Formammide | Materiale | Gruppo Roche | 11814320001 | |
| Congelatore | Strumento | Zanussi | ||
| Guanti | Materiale | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Strumento | Vysis Inc. | ||
| Olio per immersione | Materiale | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubatrice | Strumento | Heraeus Instruments | ||
| Metanolo | Materiale | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipetta | Materiale | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Punta di ricambio per micropipetta | Materiale | Daslab | 16-2001 | |
| Smalto per unghie | Materiale | Quo-cosmetics | ||
| Microscopio epifluorescenza Olympus BX60 | Strumento | Olympus Corporation | Dotato di un filtro a tre bande per DAPI/Texas Red/FITC e filtri a banda singola per Aqua, FITC e Texas Red. | |
| Pipetta di Pasteur | Materiale | Rubilabor | 211.0230 | |
| Microscopio a contrasto di fase | Strumento | Nikon Instruments | ||
| Pipetta di plastica (3 ml) | Materiale | Deltalab | 200007 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Materiale | Fluka | 60128 | |
| Colla di gomma | Materiale | Miglior test | ||
| Vetrini | Materiale | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Scatole salva-vetrini | Materiale | Deltalab | 19276.1 | |
| Contenitore sterile | Materiale | Deltalab | 409726 | |
| Siringa | Materiale | PentaFerte | 002022300 | |
| Termometro | Materiale | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Acqua tri-distillata | Materiale | |||
| Triton X-100 | Materiale | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Pinzette | Materiale | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Flusso laminare verticale cappa a flusso laminare | Strumento | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Agitatore vortice | Strumento | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Bagno a bagno maria | Strumento | Raypa® |
Riferimenti
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
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Ristampe e permessi
