Détermination de la réactivité et le titre du sérum en utilisant un dosage d'hémagglutination

Summary

Hémagglutination est une forme d'agglutination où les anticorps se lient aux globules rouges. Les globules rouges sont à la fois facilement accessibles et les résultats sont facilement observables à l'oeil nu. Cette vidéo montre les étapes nécessaires à un test d'hémagglutination, l'interprétation des résultats et de déterminer le titre.

Abstract

Hémagglutination est une forme spécifique d'agglutination et est utilisée lorsque les anticorps se lient aux globules rouges, qui agissent comme un antigène particulaire. Les globules rouges sont des cibles particulièrement utiles car elles sont facilement disponibles et d'agglutination est observable à l'oeil nu. Cette technique est couramment utilisée pour déterminer le titre d'un anticorps (Ac), pour le groupage sanguin et la quantification virale. Dans cette vidéo, les étapes impliquées dans la préparation et l'exécution d'une hémagglutination est démontré en utilisant des anticorps spécifiques à des antigènes du groupe sanguin A-ajoutée aux globules rouges (Revercells). L'antisérum est dilué en série dans un 96 puits à fond en U plateau de microtitration, à laquelle est ajoutée une suspension de Revercells. Les échantillons sont mélangés et ensuite incubées à 37 ° C pendant 60 minutes. Passé ce délai, les échantillons peuvent ensuite être facilement marqué pour VE, + ve et les réactions intermédiaires hémagglutination (-/+). Cette approche permet la réactivité et le titre d'un échantillon de sérum à être évalués en utilisant une technique rapide et simple. La vidéo couvre la théorie derrière le dosage, comment les résultats sont lus et interprétés, comment déterminer le titre, la façon dont le dosage peut être modifié et les problèmes associés à l'utilisation de cette technique.

Protocol

Préparation de la solution saline tamponnée 5x véronal (VBS)

1. Pour préparer la Saline véronal Buffered (VBS), trois solutions distinctes doivent être préparées.
2. Préparer la solution en dissolvant une 21.25gm de NaCl et d'0.94gm barbitone de sodium dans 350ml d'eau distillée. Les concentrations finales des barbitone NaCl et de sodium sont 1,02 et 13mm respectivement.
3. Préparer la solution 2 en dissolvant 1.44gm des barbitone dans 125ml d'eau distillée chaude. La concentration finale de barbitone est 62.5mm.
4. Préparer une solution 3 en dissolvant 20.33gm de MgCl ₂ et 4.41gm _de CaCl2 dans 100 ml d'eau distillée. La concentration finale de MgCl ₂ et CaCl ₂ est 2.18m et 440mm respectivement.
5. Mélanger les solutions 1 et 2 et laisser refroidir à température ambiante.
6. Une fois la solution combinée a refroidi, ajouter 1,25 ml d'une solution 3 et ajuster le pH à 7.3 à 7.5 à l'aide d'HCl 1M.
7. Ajuster le volume final à 500 ml d'eau distillée pour préparer une solution stock de 5x.
8. Pour préparer une solution 1x travail, diluer le stock de 01h05 à l'eau distillée.

Dilution de Revercells

1. Resuspendre doucement la solution stock de Revercells par inversion, puis retirez 1ml de cellules et centrifuger pendant 5 min à 600g à 4 ° C.
2. Après centrifugation, retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3ml de 1x véronal saline tamponnée.
3. Les cellules peuvent désormais être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.

Procédure

1. Transfert de 50ml 1x VBS en lignes A1-A12 d'une plaque de 96 puits à fond en U.
2. Au godet A1, ajouter 50 pl du sérum anti-A et bien mélanger à l'aide d'une pipette.
3. En utilisant une pointe de pipette propre, enlever 50 pl de liquide de puits A1 et A2 ainsi transférer. Bien mélanger et répéter ce processus jusqu'à ce que vous atteignez ainsi A11 et puis jetez le 50 pl de cette dernière ainsi.
4. L'échantillon de sérum a été dilué en série de 2 fois de 1:2 à 1:2048. Aucun sérum est ajouté à bien A12, car c'est le VBS contrôle négatif.
5. Si plus d'un échantillon de sérum doit être évaluée, répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour la ligne B, etc
6. Une fois toutes les dilutions ont été faites, ajouter 50 pl d'Revercells 1% à tous les puits. Remarque: Le Revercells réglera avec le temps et doit être doucement en suspension avant d'être distribué dans les puits.
7. Mélanger les échantillons en tapotant doucement sur le côté du plateau de microtitration, couvrir et laisser la réaction d'hémagglutination de procéder pour 1h à 37 ° C. Une salle d'incubateur ou convenablement chauffés peuvent être utilisés.
8. Après l'incubation, retirer soigneusement le plateau de l'incubateur et d'examiner la plaque d'hémagglutination. Le contrôle VBS et devrait être examinée dans le premier puits. Si la réaction est négative, alors les résultats sont valides. Si l'échantillon VBS affiche un résultat d'hémagglutination positive, alors les résultats ne peuvent être utilisés et le processus doit être répété. Une réaction d'hémagglutination positif apparaît comme une large feuille sur la base du puits, alors qu'une réaction négative apparaît comme une petite pastille concentrée de cellules dans le centre du puits. Un résultat intermédiaire aura un halo de cellules positives avec un noyau central de cellules granulées. Ce résultat se produit que le sérum a une certaine Ab qui peuvent réagir, mais des quantités insuffisantes de Ab pour provoquer une réaction complète.
9. La section des résultats représentatifs de deux représentations schématiques des résultats attendus. Un exemple d'un ensemble valable et valide des résultats est fourni. Le titre de l'anti-sérum seront également déterminés.

Les résultats représentatifs:

La vidéo comprend un exemple de résultats représentatifs. Ci-dessous (Fig.1 et Fig 2) sont deux exemples présentés de manière schématique. Le premier exemple est une réaction qui ne peut pas être interprété comme le contrôle VBS est positif, tandis que le second est un test valide qui permet le titre reste à déterminer.

Figure 1. Un exemple de l'hémagglutination où le résultat positif a échoué. Dans la représentation schématique ci-dessus, la réaction heamagglutination ne peut être acceptée. Le sérum de contrôle négatif VBS affiche une réaction d'hémagglutination positifs comme en témoigne la formation de la feuille à la base du puits. Cela indique qu'une erreur s'est produite et que les résultats ne peuvent pas être acceptés. Dans ce cas, le processus doit être répété.

Figure 2. Un exemple de l'hémagglutination où le résultat positif a fonctionné correctement. Dans la représentation schématique, la réaction heamagglutination est valide. Le VBS contrôle négatif affiche une réaction négative hémagglutination unes en témoigne le culot qui s'est formé à la base du puits. Le dernier puits positif est la ligne 7, qui indique que le titre de cet échantillon de sérum est de 128 (c'est à dire l'inverse de 1 / 128). Ce serait un exemple d'un anticorps qui est présent en quantité modérée dans le sérum.

Discussion

Le test d'hémagglutination est une technique très simple qui permet à un grand nombre d'échantillons de sérum pour être évalué dans un court laps de temps. Il a également l'avantage d'être lu sans avoir besoin d'équipement spécialisé, à l'œil étant adapté. Cette technique peut également être modifiée pour la détection de l'hormone gonadotrophine chorionique humaine présente dans l'urine, dans le cadre d'un test d'inhibition d'hémagglutination. Par rapport à un test d'hémagglutination standard, il existe quelques domaines où les soins doivent être prises pour que le test soit effectué correctement. Tout d'abord, cette technique est basée sur le règlement des cellules sur une surface concave. En tant que tel, il est essentiel que d'un fond en U ou en rond plaque de microtitration est utilisé. L'utilisation d'une plaque à fond plat comme il est couramment utilisé pour l'ELISA n'est pas convenable, que les réactions positives et négatives apparaissent identiques. Il devrait aussi être apprécié que lorsque différents échantillons de sérum sont utilisés, anticorps réactifs sont susceptibles d'être présents à des concentrations différentes. A la concentration d'anticorps élevée, l'antigène (Revercells) peut être limitant et un effet de prozone peut être observé. Toutefois cela n'affectera pas la détermination de la valeur titre, puisque cela est déterminé comme étant le dernier puits où une réaction positive a été vu la dernière fois. Enfin, cette technique n'est pas quantitative, le niveau absolu des anticorps réactifs dans le sérum n'est pas connue. Cependant, dans la plupart des cas, ce n'est pas nécessaire, surtout lorsque la détermination de la réactivité à un antigène connu est l'ensemble des informations qui sont nécessaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Revercells	CSL	02490201	Use at 1% final
Anti-A serum	CSL	02611305
96 well U bottom plate	TRP	92097	Must be U-bottom
Veronal buffered saline			Use at 1x final
37°C room/incubator
Disposable gloves