La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni.
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Articolo metodologico
Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti
In questo articolo
Sommario
Abstract
DNA a doppio filamento (DSB), che sono indotti da processi metabolici sia endogena o da fonti esogene, sono una delle lesioni del DNA più critici in termini di sopravvivenza e la conservazione dell'integrità del genoma. Una risposta presto per l'induzione di DSB è la fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX
Protocollo
Preparazione delle cellule
- Cheratinociti umani (FEP-1811) sono state coltivate in cheratinociti-siero Media gratuito (K-SFM; Invitrogen) integrato con il fattore di crescita epidermico, estratto di ipofisi bovina e 20 mg / ml di gentamicina, a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Una sospensione singola cella è stata preparata da staccare con tripsina-EDTA (0,05% v / v)
- Le cellule sono state seminate a 8-Tek ben Lab II diapositive microchamber (10.000 cellule / pozzetto) e le diapositive sono state incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2.
Irradiazione
- Le cellule sono state irradiat....
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Discussione
In seguito all'esposizione a radiazioni ionizzanti (raggi γ), γH2AX forma foci rapidamente e numeri focolai raggiungono un massimo tra 30-60 minuti 2. Pertanto, il nostro 1 ora dalla irradiazione punto di tempo riflette la formazione iniziale DSB. Abbiamo usato la dose di radiazioni clinicamente rilevante di 2 Gy per il nostro esperimento. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato per dosi di radiazioni fino a 4 Gy per il rilevamento di formazione iniziale DSB; sovrapposizione significativa di focolai pre.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Mezzo privo di siero per cheratinociti (K-SFM) | Mezzi | Invitrogen | 17005042 | Mezzo per cheratinociti integrato con fattore di crescita epidermico ricombinante umano 1-53 (EGF 1-53) ed estratto di ipofisi bovina (BPE). |
| Slide con camere Lab Tek II (8 pozzetti) | Slide con camere | Nalge Nunc International | NUN154534 | |
| Coprioggetti (22x50 mm) | Coprioggetti | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | La BSA (1%) viene utilizzata per bloccare eventuali legami non specifici degli anticorpi. Gli anticorpi primari e secondari vengono diluiti nella BSA. | |
| PBS (senza Ca2+ e Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Tripsina-EDTA 0,5% x10 | Invitrogen | 15400-054 | Tripsina-EDTA (0,05%) utilizzata per staccare le cellule dai flaconi di coltura. | |
| Triton X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | T8787 | Il Triton X-100 (0,1%) viene utilizzato per permeabilizzare le cellule. |
| Paraformaldeide | Reagente | Sigma-Aldrich | 158127 | La paraformaldeide (4%) viene utilizzata per fissare le cellule. |
| Anticorpo monoclonale murino anti-fosfo istone-H2AX | Anticorpo primario | EMD Millipore | 16193 | Diluizione dell'anticorpo primario (1:500) in BSA al 1%. |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) | Anticorpo secondario | Invitrogen | 11029 | Diluizione dell'anticorpo secondario (1:500) in BSA al 1%. |
| TOPRO3 | Colorante per DNA | Invitrogen | T3605 | Colorante per DNA comunemente usato: cloridrato di 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Può essere utilizzato solo con microscopi dotati del laser di eccitazione appropriato. |
| ProLong Gold | Soluzione anti-sfaldamento | Invitrogen | P36930 | Indice di rifrazione di 1,42 a 20°C. |
| Flacone per coltura cellulare, con tappo ventilato | Flacone di coltura | BD Biosciences | 353112 | |
| Piatto per coltura cellulare (150x25 mm) | Piatto di Petri | BD Biosciences | 353025 | |
| Vasetto Coplin, in vetro | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Recipiente per colorazione | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Irradiatore Gammacell 1000 Elite | Irradiatore a raggi gamma | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocale | Microscopio confocale | |||
| Metamorph | Software per l'analisi delle immagini | Molecular Devices |
Riferimenti
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V.
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Ristampe e permessi
