In situ frazionamento subcellulare delle cellule di mammifero su vetrini microscopio permette la visualizzazione della localizzazione delle proteine.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Funzione della proteina è intimamente unita alla localizzazione delle proteine. Sebbene alcune proteine sono limitate a una posizione specifica o compartimento subcellulare, molte proteine sono presenti come una popolazione liberamente diffondere in libero scambio con una sotto-popolazione che è strettamente associata a un determinato dominio o struttura subcellulare. Frazionamento subcellulare in situ permette la visualizzazione di compartimentalizzazione delle proteine e può anche rivelare le proteine sotto-popolazioni che si localizzano a strutture specifiche. Per esempio, la rimozione di proteine solubili citoplasmatici e vagamente tenuto proteine nucleari in grado di rivelare l'associazione stabile di alcuni fattori di trascrizione con cromatina. Successiva digestione del DNA possono in alcuni casi rivelano associazione con la rete di proteine e RNA che viene collettivamente definito il nucleare patibolo o matrice nucleare.
Qui si descrivono le operazioni necessarie durante il frazionamento in situ di cellule di mammifero aderenti e non aderenti a lamelle microscopio. Visualizzazione di proteine può essere ottenuto utilizzando anticorpi specifici o proteine di fusione fluorescenti e microscopia a fluorescenza. Anticorpi e / o coloranti fluorescenti che agiscono come marcatori per specifici comparti o strutture consentono la localizzazione delle proteine da mappare nel dettaglio. Frazionamento in situ può anche essere combinato con western blotting per confrontare la quantità di proteine presenti in ogni frazione. Questo semplice approccio biochimico in grado di rivelare le associazioni che altrimenti rimarrebbero inosservati.
Protocollo
I. Preparazione per il frazionamento
Questa sezione descrive la preparazione di poli-L-lisina coprioggetto microscopio rivestiti e l'attaccamento di cellule prima del frazionamento. Se necessario le cellule possono essere transitoriamente transfettate con vettori di espressione delle proteine prima o dopo l'attaccamento.
A. Preparazione del coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina
- Preparare una soluzione di 1mg/ml poli-L-lisina in acqua distillata.
- Coprioggetto cappotto pulito, con poli-L-lisina in incubazione, in nella soluzione per almeno 1 ora su una piattaforma oscillante a 22 ° C.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Problemi comuni e suggerimenti:
Tutti o la maggior parte delle cellule sono persi durante il lavaggio. Durante le fasi di lavaggio deve essere aggiunto lentamente al lato del 6-pozzetti evitando il coprioggetto. Allo stesso modo i liquidi devono essere rimossi con attenzione inclinando la piastra e lentamente pipettaggio l'eccesso di liquido. L'adesione cellulare può essere aumentata mediante coprioggetto rivestiti di poli-L-lisina.
DNA genomico non è del tu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Anyaporn Sawasdichai e Nazefah Abdul Hamid grati al governo tailandese e il Governo della Malaysia, rispettivamente per dottorato di ricerca Borse di studio. Questo lavoro è stato finanziato da un progetto Wellcome Trust sovvenzione concessa a PSJ e KG. Siamo anche grati per l'Università di Bristol Fondo Bioimmagini Wolfson.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| BSA | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poli-L-lisina | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Tripsina | Prodotto chimico | |||
| EGTA | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Formaldeide | Prodotto chimico | VWR | 284216N | |
| PIPES | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Saccarosio | Prodotto chimico | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Prodotto chimico | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mezzo di montaggio con DAPI | Prodotto chimico | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Reagente di trasfezione Fugene 6 | Prodotto chimico | Roche Group | 11814443001 | |
| Proteina H1 | Anticorpi | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamina A/C | Anticorpi | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulina-α | Anticorpi | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
Riferimenti
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
