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Abstract

Fonte: Koemans, T. S., et al. Condizionamento del corteggiamento della Drosophila come misura dell’apprendimento e della memoria. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive un classico test di condizionamento che mette alla prova l’apprendimento e la memoria in Drosophila, chiamato condizionamento del corteggiamento. Il test si basa sulla riduzione del corteggiamento maschile dopo aver sperimentato un rifiuto da parte di una femmina preaccoppiata non ricettiva. Il protocollo di esempio mostra una configurazione per la procedura che può essere utilizzata per valutare la memoria a breve e lungo termine.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: Nel protocollo descritto di seguito, viene descritta una replica di raccolta, formazione e test. Al fine di testare la riproducibilità dei risultati, questi passaggi devono essere ripetuti in parallelo, in più giorni e con gruppi separati di mosche (Tabella 1). Il protocollo si basa su un ciclo di vita di 10 giorni dall’uovo all’adulto, che è normale quando si allevano mosche in condizioni costanti di 25 °C, 70% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore. Tutti gli aspetti di questo protocollo presuppongono che le condizioni siano mantenute costanti durante l’intero test. I tempi sono indicati come ore prima dell’accensione delle luci (BLO) o dopo l’accensione delle luci (ALO) nell’incubatrice, in quanto questo può essere comodamente impostato a seconda dell’ora del giorno preferita dal ricercatore. Utilizzare il gas CO₂ solo per la raccolta iniziale di mosche maschi naïve e per la raccolta di femmine preaccoppiate. Questo protocollo per il condizionamento del corteggiamento è composto dalle seguenti fasi:

1. Istituzione di culture di collezione femminili preaccoppiate
2. Istituzione di colture per la raccolta di soggetti di sesso maschile
3. Preparazione di blocchi abitativi
4. Istituzione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine preaccoppiate standardizzate
5. Raccolta di soggetti di test maschili
6. formazione
7. collaudo
8. Analisi dei dati video e statistiche

1. Istituzione di Culture di Collezioni Femminili Preaccoppiate

1. Prepara il powerfood. Far bollire lo 0,8% (p/v) di agar, l’8% (p/v) di lievito, il 2% (p/v) di estratto di lievito, il 2% (p/v) di peptone, il 3% (p/v) di saccarosio, il 6% (p/v) di glucosio, lo 0,05% (p/v) di MgSO₄ e lo 0,05% (p/v) di CaCl₂ in acqua per 15 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione a 70 °C prima di aggiungere 0,05% (p/v) di metilparabene (ATTENZIONE: tossico) e 0,5% (v/v) di acido propionico (ATTENZIONE: tossico). Mescolare bene mescolando e raffreddando ulteriormente a 50 °C per ottenere una soluzione omogenea.
2. Prima che il cibo si solidifichi a temperatura ambiente, aggiungere ~50 ml di powerfood a ciascuna fiala di plastica da 175 ml. Lasciare raffreddare ulteriormente il cibo. Chiudere il flaconcino con un plug.
   NOTA: Powerfood è una miscela alimentare specializzata formulata specificamente per la produzione di un gran numero di mosche, presumibilmente inducendo la deposizione delle uova. Powerfood non viene utilizzato per produrre mosche maschi che verranno utilizzate per l’analisi del comportamento (fase 2) perché la dieta atipica e il potenziale affollamento potrebbero influenzare lo sviluppo.
3. Il giorno -11 (Tabella 1), iniziare 5-20 colture wildtype con circa 60-100 mosche (un mix di maschi e femmine) in fiale di powerfood; queste saranno utilizzate nella fase 4 per produrre femmine preaccoppiate standardizzate. Aggiungere una carta da filtro a ogni fiala per aumentare l’area su cui le larve possono impuparsi; Ciò aumenterà il numero di mosche che possono chiudere.
4. Ripetere periodicamente i passaggi 1.1-1.3 durante l’esperimento per ottenere un numero sufficiente di mosche appena riunite come input per la “creazione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine preaccoppiate standardizzate” (fase 4).

2. Istituzione di culture per la raccolta di soggetti di prova maschili

1. Preparare cibo normale, fatto con lo 0,5% (p/v) di agar, il 2,75% (p/v) di lievito, il 5,2% (p/v) di farina di mais, l’11% (p/v) di zucchero, lo 0,05% (p/v) di metilparabene e lo 0,5% (v/v) di acido propionico in acqua, come descritto nei passaggi 1.1 e 1.2. Chiudere i flaconcini di plastica da 175 ml con un tappo a fiala a mosca.
2. Il giorno -10 (Tabella 1), posizionare circa 10-20 maschi con circa 30-75 femmine vergini (Tabella Materiali/Attrezzature) in ogni fiala da 175 ml contenente cibo normale. Aggiungere una carta da filtro per aumentare la superficie per l’impupamento e massimizzare la produttività.
3. Stabilire da tre a sei fiale da 175 ml per genotipo per ottenere il numero richiesto di maschi soggetti del test.
   NOTA: Potrebbero essere necessarie più fiale, a seconda della produttività del genotipo desiderato.

3. Preparazione dei blocchi abitativi (Figura 2A)

1. Sciogliere circa 50 ml di powerfood per blocco abitativo in un forno a microonde o prepararlo fresco.
2. Aggiungere 500 μl di powerfood a ciascun pozzetto di un blocco a fondo piatto a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multidispenser.
3. Lasciare solidificare il cibo a temperatura ambiente.
4. Coprire i blocchi con pellicola adesiva PCR e utilizzare un ago per praticare almeno 4 fori per pozzetto per fornire aria fresca alle mosche.
5. Per poter aprire ogni pozzo, utilizzare una lama di rasoio per tagliare la pellicola adesiva nel senso della lunghezza tra ogni fila. Lasciare intatta la pellicola su un’estremità del blocco.
6. I blocchi possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 2 giorni.
   NOTA: Lasciare che i blocchi si riequilibrino a temperatura ambiente prima dell’uso.

4. Istituzione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine preaccoppiate standardizzate

1. Il giorno -1, rimuovere e scartare tutte le mosche adulte di tipo selvatico dalle colture di raccolta femmina preaccoppiate a 2-5 ore BLO.
2. Raccogli le mosche usando l’aspiratore (Figura 2B) da queste fiale a intervalli di 2 o 3 ore (ad esempio, a 30 min, 2,5 ore e 5 ore di ALO) e mettile in una nuova fiala powerfood integrata con una piccola quantità di pasta di lievito e carta da filtro.
3. Per evitare l’affollamento e favorire un’atmosfera di accoppiamento ottimale, non trasferire più di 150-200 mosche in ogni nuova fiala. Garantire l’accoppiamento di tutte le femmine fornendo almeno il 25% di maschi. Assicurarsi che nelle fiale di accoppiamento sia presente un numero sufficiente di femmine per adattarsi alle dimensioni dell’esperimento.
   NOTA: Poiché questo è un passaggio cruciale nel protocollo, assicurati che solo le mosche appena chiuse e nessuna vecchia mosca, larva o pupa vengano trasferite nella nuova fiala di accoppiamento.
4. Incubare queste “fiale di accoppiamento” per quattro giorni per dare a tutte le femmine il tempo sufficiente per l’accoppiamento.

5. Raccolta di soggetti di test maschili

1. Il giorno 1 (Tabella 1) a 2-3 ore BLO, utilizzare CO₂ per rimuovere tutte le mosche adulte dalle fiale di raccolta dei maschi (fase 2), ma lasciare che altre mosche si chiudano nelle prossime ore.
2. Nelle successive 5-6 ore, rimuovere le mosche appena chiuse ogni 20-30 minuti utilizzando CO₂ e mettere ogni maschio in un pozzetto individuale del blocco di alloggiamento (passaggio 3) utilizzando l’aspiratore (Figura 2B).
3. Richiudere il pozzetto con la pellicola adesiva PCR.
   NOTA: Questo è un passaggio cruciale nel protocollo. I maschi dovrebbero essere raccolti frequentemente. I maschi raccolti devono essere isolati nel blocco di stabulazione vicino al momento dell’eclosione, quando mostrano una pigmentazione pallida e la presenza del meconio nell’addome traslucido.
   NOTA: L’uso delicato dell’aspiratore permette il trasferimento delle mosche; tuttavia, un uso inappropriato stresserà le mosche, causando varianza nel test (vedi la Discussione).
4. Cerca di raccogliere fino a 48 maschi per genotipo. Ciò fornisce un piccolo eccesso rispetto al numero massimo di maschi necessari per l’analisi delle condizioni sia naïve che addestrate, consentendo una certa perdita durante le fasi successive del trasferimento.

6. Formazione

1. Rimuovere le mosche dalla fiala di accoppiamento (passaggio 4.2) utilizzando CO₂ e separare le femmine preaccoppiate dai maschi.
2. Utilizzando l’aspiratore, aggiungere una singola femmina anestetizzata e preaccoppiata a ciascun pozzetto in una fila di un nuovo blocco abitativo.
3. Utilizzando l’aspiratore e senza anestesia, trasferire un singolo maschio naïve dal blocco di stabulazione allestito al punto 5.2 al pozzetto contenente una femmina preaccoppiata. Dopo che il maschio è stato inserito nel pozzetto, richiudere immediatamente con la pellicola adesiva; Non permettere al maschio di scappare.
   NOTA: Trasferire i moscerini maschi dall’aspiratore al blocco di stabulazione sfruttando il loro naturale comportamento di “geotassis negativa”.
4. Ripetere i passaggi 6.2-6.3 fino a quando non si sono stabilite abbastanza coppie maschio-femmina. Idealmente, stabilire 24 coppie, due file complete di un blocco abitativo, per genotipo. Lasciare i maschi naïve rimanenti nel blocco abitativo originale allestito al punto 5.2.
5. Lasciare indisturbate le coppie maschio-femmina durante il periodo di allenamento (Tabella 2, Figura 1B).
   NOTA: Durante questo periodo, il maschio corteggerà e sarà rifiutato dalla femmina preaccoppiata. Per l’apprendimento e l’STM, il periodo di formazione è di 1 ora e per l’LTM, il periodo di formazione è di 7-9 ore.
6. Terminare l’allenamento (Tabella 2, Figura 1B) utilizzando un aspiratore per separare delicatamente il maschio dalla femmina preaccoppiata; non usare l’anestesia. Posizionare il maschio separato in un nuovo blocco di alloggi.
7. Utilizzare l’aspiratore per trasferire tutti i maschi ingenui delicatamente e senza anestesia dal blocco di alloggiamento allestito al punto 5.2 a un nuovo blocco di alloggiamento.
   NOTA: Questo passaggio è facoltativo per la STM e l’apprendimento, ma è molto importante per la LTM perché le mosche vengono alloggiate per ulteriori 24 ore per testare la LTM.
8. Per STM e LTM, lasciare riposare i maschi rispettivamente per 1 ora e ~24 ore (Tabella 2, Figura 1B) prima del test (fase 7).
9. Per l’apprendimento, metti immediatamente alla prova i maschi addestrati e ingenui (passaggio 7).

7. Test

1. Raccogliere le mosche dalle fiale di accoppiamento (passaggio 4.2) utilizzando CO₂ e separare le femmine preaccoppiate dai maschi.
2. Lasciare che le femmine si riprendano dall’anestesia per almeno 1 ora in una fiala contenente cibo normale.
3. Montare i videoregistratori in anticipo (Figura 2C), in modo da avere tutte le apparecchiature pronte prima dell’inizio del test.
4. Iniziare i test in base alle diverse tempistiche per l’apprendimento, STM e LTM (Tabella 2, Figura 1B). Eseguire i test immediatamente dopo l’addestramento per l’apprendimento, 1 ora dopo l’addestramento per STM e 24 ore dopo l’addestramento per LTM.
5. Usando l’aspiratore, trasferisci delicatamente un singolo maschio dal blocco di alloggi di riposo o dal blocco di alloggi di addestramento se l’apprendimento viene testato (passaggio 6.7, addestrato; passaggio 6.8, ingenuo) a metà di un’arena di corteggiamento con il divisorio chiuso (Figura 2D; vedi File S1 per un piano di costruzione).
   NOTA: L’uso del comportamento naturale della “geotassis negativa” dovrebbe essere sufficiente per trasferire i moscerini maschi dall’aspiratore all’arena di corteggiamento.
6. Sposta rapidamente ma delicatamente il foro di ingresso nell’arena successiva e ripeti il passaggio 7.5 fino a quando tutte le 18 arene contengono un maschio.
7. Utilizzando l’aspiratore e senza CO₂, aggiungere una femmina preaccoppiata (raccolta al punto 7.2) all’altra metà di tutte le 18 arene.
8. Posiziona con cura la camera di corteggiamento sotto la telecamera, con l’apertura dei pozzetti rivolta verso il basso (Figura 2C).
9. Rimuovi il divisorio delle arene per consentire l’interazione diretta tra i maschi e le femmine preaccoppiate.
10. Iniziare immediatamente a registrare il comportamento per almeno 10 min.
    NOTA: Quando si utilizza una configurazione a due telecamere, la registrazione parallela di due piastre di corteggiamento può essere eseguita in intervalli di tempo sovrapposti per massimizzare l’efficienza.
11. Svuota le arene di corteggiamento usando un aspirapolvere portatile e lascia che la camera di corteggiamento ventili prima di riutilizzarla.
12. Ripetere i passaggi 7.4-7.11 fino a quando il test di tutti i genotipi e le condizioni (cioè naïve e addestrato) è stato completato.

8. Analisi dei Dati Video e Statistiche

1. Calcola l’indice di corteggiamento (CI), definito come la percentuale di tempo che il maschio corteggia durante i primi 10 minuti del periodo di prova, per ogni singolo mosca maschio.
   NOTA: Questo può essere fatto manualmente osservando il comportamento stereotipato del corteggiamento (Figura 1A) o utilizzando un software per computer per la quantificazione automatica del comportamento del corteggiamento.
   NOTA: Si raccomanda di analizzare 40-60 maschi per condizione nel corso di tre giorni al fine di ottenere una potenza statistica sufficiente e giudicare la coerenza dei dati CI.
2. Calcola l’indice di apprendimento (LI), definito come la percentuale di riduzione dell’IC medio dei maschi addestrati rispetto ai maschi naïve (LI = (CI_naïve – CI_addestrato) / CI_naïve). Valutare l’LI per ogni giorno di test e confrontarlo con l’LI cumulativo calcolato da tutti i giorni di test combinati.
3. Crea un file di dati separato a due colonne con “Genotipo” e “CI” come intestazioni.
   NOTA: Queste intestazioni fanno distinzione tra maiuscole e minuscole. Il nome del genotipo per ogni IC deve consistere in una descrizione del genotipo seguita da un trattino basso e dalla condizione di addestramento (ad esempio, genotype_N e genotype_LTM, ecc., dove N = naïve e LTM = memoria a lungo termine; vedi File supplementare S2 per un esempio). Questa annotazione è essenziale, in quanto la funzione analearn identificherà le mosche addestrate e ingenue in base ai caratteri presenti dopo il primo trattino basso nella colonna “Genotipo”.
4. Utilizzare lo script analearn R (file supplementare S3) per eseguire un test di randomizzazione per giudicare la significatività statistica delle differenze tra i valori di LI di diversi genotipi.
   1. Genera lo script (file supplementare S3) in R, che definisce una funzione chiamata “analearn”.
      NOTA: La definizione della funzione è: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Avviare la funzione inserendo “analearn()” nella riga di comando R e selezionando il file di dati da analizzare (prodotto nel passaggio 8.3) tramite la finestra pop-up.
   3. Scegli la mutazione di riferimento, che è il genotipo di controllo, inserendo il numero corrispondente e premendo invio.
      NOTA: Dopo aver selezionato il genotipo di riferimento, lo script impiega alcuni secondi per eseguire 10.000 repliche di bootstrap.
   4. Osservare la tabella di output (Tabella 3), che contiene il genotipo, la condizione di apprendimento (ad esempio, apprendimento, STM o LTM), l’IC medio naïve, l’IC medio addestrato, LI, la differenza tra il LI del controllo rispetto alla condizione sperimentale (LI dif), il limite inferiore (LL) e il limite superiore (UL) dell’intervallo di confidenza al 95% del LI dif, e il valore p che indica la probabilità che non vi sia alcuna differenza significativa.
      NOTA: analearn memorizzerà un file di testo di output nella directory in cui si trova il file di dati. Tuttavia, la tabella di output viene visualizzata anche nella console di R-Studio. Il nome predefinito viene costruito in base al nome del file di dati fornito.
   5. Ci sono diversi argomenti nella funzione analearn che possono essere utilizzati per modificare le impostazioni predefinite della funzione per regolare i parametri del bootstrapping.
      NOTA: “nboot” definisce il numero di repliche di bootstrap ed è impostato a 10.000 per impostazione predefinita. Questo valore può essere modificato in qualsiasi numero intero maggiore di zero. La tabella 5 elenca diversi argomenti che possono essere utilizzati per modificare le impostazioni predefinite della funzione. Tuttavia, non è consigliabile utilizzare dati prodotti con un numero ridotto di repliche di bootstrap.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–