眼レンズ解剖:ゼブラフィッシュレンズ形態を観察する技術

Overview

このビデオでは、コルチカルレンズの形態とレンズ縫合糸の構造的完全性を分析するために、成体および幼虫ゼブラフィッシュレンズを解剖するために開発されたプロトコルについて説明します。

Protocol

1. ラーバルと成虫ゼブラフィッシュレンズの解剖

1. 触れることに反応しないが、まだ強い心拍を示すまで、トリカインで6dpf幼虫から成人期まで魚を麻酔する。ステージングのためのシリング(2002)ごとに魚の標準長さを測定します。
2. マイクロ解剖はさみを使用して目をただちに切除し、PBSで解剖皿に入れます (図1 は大人の目のために示しています)。
   1. レンズの切片のためのシリコーンで満たされたカスタム35ミリメートル皿を作ります。シリコーンがセットされたら、直径2〜3mm、深さ0.5mmのディボットを切除して、解剖中に大人の目/レンズを固定します。
3. 成体ゼブラフィッシュレンズの解剖
   1. PBSで満たされた皿のディボットの後部側に大人の目を置きます。光学ディスクを通して<45°の角度で鉗子を挿入することによって目を固定する。レンズをニックしたり圧縮したりしないように注意してください。視板から解剖ハサミで毛様体領域までのレチナとスクレラを通して2つまたは3つの放射状切開を行います。
   2. 花びらのようにレチナとスクレラを剥がし、目を反転させ、角膜側を上にします。はさみの平らな側で強膜と角膜の操作を介して間接的にレンズを固定し、脱生と鉗子で組織を取り出す。レンズから余分な組織を慎重にトリミングします。
      注: 一貫して健康なレンズを得るために慎重に解剖することが重要です。
4. 幼虫ゼブラフィッシュレンズの解剖
   1. PBSで満たされたシリコーン皿の平らな部分に幼虫の目の後部側を置き、別のタングステン針または鉗子で目を固定しながら、筋膜と強膜を通して放射状の切り傷を行うために鋭くタングステン針を使用します。
      注: レンズを傷つけないように注意してください。
      1. ワイヤチップを10%(w/v)NaOHに吊り下げ、低電圧交流電流14を印加することで、長さ0.1mmタングステン線の先端を電解的にシャープにします。ブンゼンバーナーを使用してガラスの端を溶かしてパスツールピペットに針を固定します。
         注: 別の微細解剖ツールも使用できます。
         注意: NaOHは腐食性です。
   2. 解離した目から針の鈍い側でレンズをそっとすくい取り出し、取り付けたティッシュを慎重に引き離します。

Representative Results

図1:ゼブラフィッシュレンズ解剖.(A) 眼は麻酔魚から解剖され、後側を上に置かれる(B)。(C)眼は、光学ディスク(od)を介して鉗子によって固定化され、2〜3つの放射状切開は、眼用ディスクからゾニクルへのレチナおよび強膜で作られる。(D) フラップを折り返してレンズを見る。(E)角膜を上向きに目を回転させ、角膜を介して間接的にレンズを固定し、スクレラ-レティナを引き離す。(F)残りのレチナと毛様体のゾーン/ゾニルをレンズから切り離す

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A