Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Abstract

Fonte: Roy, B., et al. Registrazioni di Patch Clamp da Cellule di Mauthner embrionali di Zebrafish. J. Vis. Exp. (2013).

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Protocol

1. Registrazione Patch Clamp (modalità cella intera)

1. Tutte le registrazioni vengono eseguite in modalità di patch clamp per l'intera cella. Le camere di registrazione sono posizionate su un tavolino da microscopio in una configurazione di elettrofisiologia. I nostri tavolini sono fissi e il microscopio a morsetto verticale è imbullonato a una piattaforma mobile per microscopio o a un traslatore per microscopio.
2. Le pipette patch clamp vengono tirate su un estrattore orizzontale (P-97; Sutter Instruments Co.) da vetro borosilicato a parete sottile ottenuto da WPI. I diametri dei puntali delle pipette sono dell'ordine di 0,2-0,4 μm dopo la lucidatura a fuoco fino a un bordo liscio e la conicità del gambo è lunga ~4 mm.
3. Collegare la pipetta all'head-stage dell'amplificatore nella configurazione di elettrofisiologia. È importante mantenere l'head-stage a circa 45° di angolo rispetto all'asse orizzontale, in quanto ciò garantisce un angolo di ingresso della pipetta adatto alla formazione di guarnizioni ad alta resistenza sulla cella Mauthner.
4. Poco prima di entrare nella soluzione del bagno, applicare una piccola quantità di pressione positiva sulla pipetta per ridurre la possibilità di sporcare il puntale. Durante la registrazione delle mEPSC, le soluzioni per il bagno includono 1 μM di TTX per bloccare i potenziali d'azione, 5 μM di stricnina per bloccare i recettori della glicina e 10 μM di bicucullina o 100 μM di picrotossina per bloccare i recettori GABAA. Durante la registrazione delle mIPSC, le soluzioni per il bagno includono 1 μM di TTX, acido chinurenico e bicucullina o stricnina a seconda dell'attività del recettore di interesse.
5. Avvicinarsi alla cellula M con una piccola quantità di pressione positiva nella pipetta. La pressione positiva spinge delicatamente la cellula da un lato all'altro e, quando viene posizionata immediatamente sopra la cellula, forma una piccola fossetta sulla membrana cellulare. Lasciare la pipetta in posizione per alcuni secondi per pulire delicatamente la superficie cellulare in modo da formare una forte tenuta tra la pipetta e la membrana. Il rilascio della pressione positiva nella pipetta consente l'avvio della sigillatura e una piccola quantità di pressione negativa abbinata a potenziali di pipetta negativi provoca la formazione di guarnizioni GigaΩ in pochi secondi.
6. Modificare il potenziale di mantenimento dell'amplificatore a -60 mV. Rompere la membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione. Registra immediatamente i potenziali di membrana e minimizza gli artefatti di capacità. Compensa la capacità della cella (Cm) e la resistenza di accesso (serie) (Ra) del 70-85%. L'artrite reumatoide deve essere monitorata di routine, ogni 30 secondi o un minuto, e se c'è una variazione del 20% o più, interrompere l'esperimento.
7. Una volta terminato l'esperimento e acquisiti dati sufficienti, la preparazione viene sacrificata rimuovendo il rombencefalo con un paio di pinze. A questo punto, può iniziare l'analisi dei dati.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrattore per pipette	Sutter Instruments Co	P-97
Microscopio a morsetto verticale	Leica Microsystems	DMLFSA
amplificatore	Dispositivi molecolari	200 miliardi
Micromanipolatore	Siskiyou Inc.	MX7500