Prelievo di sangue retro-orbitale: un metodo per isolare le cellule mononucleate dal seno retro-orbitale di un topo

Abstract

Fonte: Mopin A. et al. Un protocollo dettagliato per la caratterizzazione della linea cellulare murina C1498 e del suo modello murino di leucemia associata. J. Vis. Exp. (2016)

Il video descrive un metodo di campionamento per la raccolta di sangue periferico dal seno retro-orbitale di un topo e l'ulteriore isolamento di cellule mononucleate dal sangue con centrifugazione a gradiente di densità.

Protocollo

1. Raccolta di sangue retroorbitale

1. Eseguire il prelievo di sangue retroorbitale appena prima dell'eutanasia in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare e sotto una lampada riscaldante per prevenire l'ipotermia.
2. Per l'anestesia, utilizzare la ketamina a 150 mg/kg e la xilazina a 10 mg/kg. Preparare la soluzione anestetica diluendo 1,5 ml di ketamina e 0,5 ml di xilazina in 18 ml di soluzione di PBS.
3. Inserire un tubo capillare nel canto mediale dell'occhio. Il sangue salirà dal seno orbitale nel tubo capillare. Controlla l'emorragia applicando delicatamente una pressione sull'occhio con una spugna di garza sterile.
   nota: Con questa tecnica è possibile raccogliere un volume da 100 a 200 μl di sangue.
4. Raccogliere il sangue in una provetta EDTA e conservare il campione su ghiaccio prima di isolare le cellule mononucleate.

2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue

1. Trasferire il campione di sangue (da 100 a 200 μl; ottenuto dal passaggio 1.1) in una provetta da microcentrifuga e aggiungere la soluzione di PBS/1 mM EDTA fino a raggiungere il volume della soluzione di 500 μl. Stratificare con cura 500 μl di soluzione di separazione sotto la soluzione contenente il sangue utilizzando un ago da 30 G e una siringa da 1 ml. Non mescolare il sangue e la soluzione separante.
2. Centrifugare le provette a 800 x g (senza freno) per 20 minuti a RT. Dopo la centrifugazione, prelevare l'anello cellulare (lo strato bianco opaco) utilizzando una pipetta. Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga.
   nota: Lo strato bianco opaco contiene sia linfociti che monociti e appare tra lo strato inferiore - la soluzione di separazione - e lo strato superiore.
3. Aggiungere 1 ml di soluzione di PBS e centrifugare la provetta a 350 x g per 10 minuti. Risospendere le cellule in 600 μl di tampone FACS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketamina 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3.59713E+12
Xilazina SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
Soluzione di PBS (1x concentrato)	ThermoFisher Scientifico	Codice: 14190
Soluzione ultrapura di EDTA 0,5 M, pH 8,0	ThermoFisher Scientifico	Codice: 15575
Soluzione di separazione (Topo Pancoll)	PANBIOTECH	P04-64100
Tubo EDTA	Greiner Bio-One	454034
Pipetta Pasteur 150 mm (tubo capillare)	Fisherbrand	Codice 1154-6963
Provette per citometria a flusso (blu)	Beckman Coulter	2523749
Provetta per microcentrifuga (1,5 ml)	ThermoFisher Scientifico	05-408-129
Spugne di garza sterili	URGO	Codice: 501580
Ferri da 30 g	Becton & Dickinson	Codice 304000
Siringa da 1 ml	Terumo	SS-01T
Citocentrifuga Shandon Cytospin 3	ThermoFisher Scientifico