Innesto di isole pancreatiche: un metodo per impiantare le isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per l'imaging in vivo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di jove

1. Preparazione dell'attrezzatura per i trapianti e del tavolo operatorio

NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave e il tavolo operatorio e gli strumenti disinfettati con alcol al 70%.

1. Collegare un supporto per la testa stereotassico all'anestesia tramite una maschera nasale e accendere il termoforo.
2. Collegare una siringa Hamilton a tenuta di gas al tubo in polietilene e a una cannula oculare con estremità smussata.
   nota: Si consiglia di riempire tutte le parti con PBS prima del montaggio. Verificare la presenza di bolle d'aria intrappolate e rimuoverle se presenti.
3. Fissare saldamente la siringa di Hamilton al tavolo (Figura 1a) o a una base mobile (Figura 1e) e collegare il tubo allo stereomicroscopio, con la cannula che pende verso il basso (cioè in posizione di attesa).
   nota: Usa il nastro chirurgico, perché è facile da rimuovere e riattaccare.
4. Preparare una siringa da 1 ml collegata a un ago da 30 G riempito con 0,1 mg/kg di soluzione di buprenorfina.
5. Preparare una siringa con PBS sterile. In alternativa, utilizzare una pipetta.
6. Metti da parte una gabbia di risveglio pulita con una lampada riscaldante.

2. Anestesia e posizionamento dei topi riceventi per l'intervento chirurgico

NOTA: Tutti gli animali sono stati allevati e mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni presso le strutture per animali dell'Università di Lund.

1. Anestetizzare il topo in una camera riempita con isoflurano al 40% O₂/60% N₂/3% e trasferire il mouse anestetizzato sulla piattaforma di supporto della testa su un termoforo caldo (Figura 1a). Verificare la mancanza di riflessi sul pedale.
   nota: L'anestesia con isoflurano è il metodo di anestesia preferito per un rapido recupero dopo l'intervento chirurgico. La sala del microscopio deve essere adeguatamente ventilata per l'utilizzo dell'isoflurano.
2. Posizionare il muso del topo nella maschera per anestesia collegata alla macchina per anestesia con isoflurano al 40%_{O 2} /60% N₂ 0,9%–1,5%. Usa il pollice e l'indice per sollevare leggermente la testa e fissarla usando i pezzi metallici sui lati. Assicurati che gli auricolari fissino la testina direttamente sotto le orecchie. Iniettare 0,1 mg/kg di soluzione di buprenorfina per via sottocutanea sul dorso del topo.
   nota: La buprenorfina è usata come analgesico.
3. Inclinare la testa in modo che l'occhio da operare sia rivolto verso l'alto e sia vicino al ricercatore.
4. Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare utilizzando una pinza smussata, estrarre l'occhio e fissarlo liberamente con un paio di pinzette. Assicurarsi che le punte delle pinzette siano coperte con un tubo di polietilene fissato alla piattaforma del supporto della testa (Figura 1a, riquadro).
5. Tenere sempre entrambi gli occhi bagnati applicando una goccia di PBS sterile sull'occhio.
6. Trasferire le isole umane dalla provetta sigillata da 1,5 mL (sezione 1) a una piastra di Petri con PBS sterile e assicurarsi che le isole siano vicine l'una all'altra per ridurre al minimo la quantità di terreni di coltura cellulare trasferiti (Figura 1c).
7. Raccogliere ~20-30 isole nella cannula oculare collegata tramite tubo di polietilene alla siringa Hamilton.
   nota: Prelevare meno liquido possibile con le isole.
8. Appendere il tubo a testa in giù e fissarlo allo stereomicroscopio (Figura 1d). Fissare con cura il tubo per far affondare le isole fino all'estremità del tubo verso la cannula.

3. Procedura di trapianto

NOTA: Questo metodo è stato precedentemente descritto per il trapianto di isole di topo. Qui viene presentata una procedura leggermente modificata.

1. Pizzica i cuscinetti sulle zampe posteriori per assicurarti che il mouse sia addormentato.
2. Stringere la pinza che trattiene l'occhio senza interrompere il flusso sanguigno e applicare una goccia di PBS sterile sull'occhio.
3. Utilizzando un ago da 25 G come bisturi, smussare verso l'alto, penetrare con cura solo metà della punta nella cornea e praticare un'unica incisione laterale. Fai il foro con un angolo verso l'alto; il foro si sigillerà più facilmente dopo il trapianto (Figura 1f).
4. Sollevare con cautela la cornea con la cannula precaricata con le isole e applicare lentamente le isole nell'occhio. Evitare l'inserimento della cannula nella camera anteriore per evitare danni all'iride, ma piuttosto spingere con cautela contro l'apertura corneale (Figura 1g). Ritrarre lentamente la cannula dall'ACE.
   nota: Puntare a un volume di iniezione di 3-8 μl. Se il volume è troppo grande, esporrà l'occhio a una pressione intraoculare inutilmente elevata e potrebbe provocare il reflusso delle isole iniettate fuori dalla camera anteriore.
5. In caso di difficoltà con l'inserimento delle isole a causa dell'aumento della pressione nella camera oculare, allargare il sito di incisione rinforzando il sito di incisione laterale e riapplicare le isole.
   nota: Occasionalmente, le bolle d'aria introdotte possono essere utilizzate come supporti per lo spazio.
6. Applicare il gel oculare sull'occhio, allentare la pinza di contenimento oculare e lasciare il mouse sull'isoflurano nella stessa posizione per 8-10 minuti per consentire alle isole di fissarsi.
7. Rimuovere la pinza che tiene la palpebra e rimettere la palpebra nella sua posizione normale.
8. Rimuovere il mouse dal supporto per la testa e trasferirlo in una gabbia di risveglio.
9. Quando il topo è sveglio e in movimento, trasferirlo nuovamente nella gabbia originale e conservarlo nel recinto dell'animale fino alla scansione (si consigliano almeno 5 giorni).

Figura 1: Trapianto di isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio.
(a) Allestimento del trapianto che mostra il topo anestetizzato fissato nel supporto della testa stereotassica e l'occhio esposto (riquadro) accanto alla siringa di Hamilton preparata fissata al tavolo e lo stereomicroscopio pronto per prelevare le isole di topo (b) o le isole umane (c). (d) Posizione di attesa della cannula oculare caricata con le isole. (e) trapianto in corso e (f) disegno schematico di una singola incisione laterale utilizzata per sollevare con cautela la cornea con la punta della cannula oculare e dispensare le isole nella camera anteriore (g). Immagine dell'occhio subito dopo l'iniezione di isole di topo (h) o di isole umane (i). Barra di scala = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.